DNA sanger测序法原理

覃振东覃振东 复旦大学生物技术中心复旦大学生物技术中心 DNADNA测序测序技术技术 DNADNA测序测序 DNADNA是是一种长链聚合物，组成单位为四种一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸脱氧核苷酸( (dATPdATP dTTPdTTP dCTPdCTP dGTPdGTP) )。这些。这些碱基沿着碱基沿着DNADNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，长链所排列而成的序列，可组成遗传密码， 指导蛋白质的合成。测序分析能够为基因指导蛋白质的合成。测序分析能够为基因DNADNA序列提供最真实可靠的信序列提供最真实可靠的信 息，它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性。息，它可以比较全面地描述基因的复杂性和多样性。 测定未知测定未知序列序列 研究基因组多样性研究基因组多样性 确定重组确定重组DNADNA的方向与的方向与结构结构 对突变进行定位和对突变进行定位和鉴定鉴定 DNADNA测序的发展历程（测序的发展历程（1 1） 经典经典DNADNA测序技术测序技术 7070年代末年代末，MaxamMaxam和和GilbertGilbert发明发明化学法化学法、SangerSanger发明双脱氧终发明双脱氧终 止法手动止法手动测序（同位素标记）测序（同位素标记） 8080年代中期，出现自动测序仪（年代中期，出现自动测序仪（应用应用SangerSanger双双脱氧终止法原脱氧终止法原 理）、荧光代替同位素理）、荧光代替同位素，采用计算机，采用计算机图象识别图象识别 9090年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶 电泳电泳 20012001年完成人类基因组框架年完成人类基因组框架图，全部采用基于图，全部采用基于SangerSanger双双脱氧原脱氧原 理的自动化毛细管测序。理的自动化毛细管测序。 DNADNA测序的发展历程（测序的发展历程（2 2） 新新测序方法测序方法 杂交测序法杂交测序法 质谱法质谱法 单分子测序法单分子测序法 原子探针显微镜测序法原子探针显微镜测序法 流式细胞仪测序法流式细胞仪测序法 大规模平行实测法、大规模平行实测法、DNADNA芯片芯片法法 边合成边边合成边测序法测序法( (二代测序二代测序) ) MaxamMaxam- -GilbertGilbert化学化学法测序法测序 基本原理是用基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的化学试剂处理具有末端放射性标记的 DNADNA片段片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不 同长度的同长度的DNADNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自 显影之后，可直接读出待测显影之后，可直接读出待测DNADNA片段的核苷酸序列。片段的核苷酸序列。 SangerSanger双末端终止法测序双末端终止法测序 19771977年，年，英国人英国人Frederick SanFrederick San ger ger 创建创建了双脱氧链末端合成了双脱氧链末端合成 终止法（终止法（chain termination mchain termination m ethodethod），简称），简称SangerSanger法、双脱法、双脱 氧法或酶法氧法或酶法。他发现如果。他发现如果在在DNADNA 复制过程中掺入复制过程中掺入ddNTPddNTP，就会产，就会产 生一系列末端终止的生一系列末端终止的DNADNA链，并链，并 能通过电泳按长度分辨能通过电泳按长度分辨。不同不同 末端终止末端终止DNADNA链的长度是由掺入链的长度是由掺入 到新合成链上随机位置的到新合成链上随机位置的ddNTPddNTP 决定的。决定的。 Frederick SangerFrederick Sanger：19801980年年 因发明测序技术获得诺贝尔化学奖因发明测序技术获得诺贝尔化学奖 基本原理基本原理是利用是利用DNADNA聚合酶聚合酶，以待测单链以待测单链DNADNA为模板为模板，以以 dNTPdNTP为底物为底物，设立四种相互独立的测序反应体系设立四种相互独立的测序反应体系，在每在每 个 反 应 体 系 中 加 入 不 同 的 双 脱 氧 核 苷 三 磷 酸个 反 应 体 系 中 加 入 不 同 的 双 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 （dideoxyribonucleosidedideoxyribonucleoside triphosphatetriphosphate，ddNTPddNTP）作为作为 链延伸终止剂链延伸终止剂。在测序引物引导下在测序引物引导下，按照碱基配对原则按照碱基配对原则， 每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通通 过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显放射自显 影检测后影检测后，从凝胶底部到顶部按从凝胶底部到顶部按5 53 3方向读出新合方向读出新合 成链序列成链序列，由此推知待测模板链的序列由此推知待测模板链的序列 。 SangerSanger双末端终止法测序双末端终止法测序 DNADNA复制复制是是指遗传物质的传代，以母链指遗传物质的传代，以母链DNADNA为模板合成子链为模板合成子链DNADNA的过程。的过程。 A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C 脱氧核糖核苷脱氧核糖核苷 酸通过形成酸通过形成3 3 , , 5 5 - -磷酸二酯键磷酸二酯键 延长延长DNADNA链链 DNADNA复制复制 双脱氧链终止法的双脱氧链终止法的测序基础测序基础是以双脱氧核苷三磷酸（是以双脱氧核苷三磷酸（ddNTPddNTP）为）为 测序反应的链终止剂。测序反应的链终止剂。 链终止原理链终止原理 SangerSanger双末端终止法双末端终止法测序流程测序流程 在在4 4组相互独立的测序反应体系中组相互独立的测序反应体系中，分别加入四种不同分别加入四种不同 ddNTPddNTP，其余成分相同其余成分相同。调整每个测序反应中调整每个测序反应中dNTPdNTP与与 ddNTPddNTP的比例的比例，使引物的延伸在对应于待测模板使引物的延伸在对应于待测模板DNADNA每个每个 可能掺入的位置都有可能发生终止可能掺入的位置都有可能发生终止。 产生产生4 4组分别终止于互补链组分别终止于互补链3 3末端的每一个末端的每一个A A、G G、C C和和T T 位置上的一系列长度的核苷酸链位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚通过高分辨率变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测，直接读出新合成直接读出新合成 DNADNA链的序列链的序列。 ddNTPddNTP一一种特殊核苷酸，双脱种特殊核苷酸，双脱 氧核苷三氧核苷三磷酸，磷酸，因为它与普通因为它与普通 dNTPdNTP不同，在脱氧核糖的不同，在脱氧核糖的33 位置缺少一个羟基，故不能同位置缺少一个羟基，故不能同 后续的后续的dNTPdNTP形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。 双脱氧链末端终止法测序原理示意图双脱氧链末端终止法测序原理示意图 SangerSanger双末端终止法双末端终止法测序测序 1 1单链模板单链模板DNADNA SangerSanger法使用的经典测序反应是将待测法使用的经典测序反应是将待测DNADNA片段克隆于片段克隆于M M1313mpmp载体载体 中中，得到单链的得到单链的DNADNA模板模板，再按再按SangerSanger法进行测序法进行测序。 2 2双链模板双链模板DNADNA 将待测的将待测的DNADNA片断克隆到质粒载体上片断克隆到质粒载体上，得到含待测得到含待测DNADNA克隆片断的克隆片断的 双链质粒双链质粒，通过碱变性处理通过碱变性处理，再与寡核苷酸引物序列一起退火再与寡核苷酸引物序列一起退火， 然后按然后按SangerSanger法进行测序法进行测序。 PCRPCR产物产物 待测模板待测模板 SangerSanger双末端终止法双末端终止法测序测序 在在DNADNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链不论是单链DNADNA模模 板板，还是双链还是双链DNADNA模板模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互 补的补的“通用通用”引物引物。 通用引物的长度一般为通用引物的长度一般为15153030个核苷酸个核苷酸。 如果是如果是PCRPCR产物直接测序产物直接测序，也可以用一端的也可以用一端的PCRPCR引物引物 引物引物 SangerSanger双末端终止法双末端终止法测序测序 测序酶是一种经过修饰的测序酶是一种经过修饰的T T7 7噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶， 消除了消除了3 35 5外切酶活性外切酶活性。该酶活性非常稳该酶活性非常稳 定定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应 速度速度，是测定较长是测定较长DNADNA的首选酶的首选酶。 测序酶（测序酶（sequenasesequenase） SangerSanger双末端终止法双末端终止法测序测序 能否将测序反应中产生的各能否将测序反应中产生的各 种不同长度的种不同长度的DNADNA片段进行有片段进行有 效分离是序列分析成败的关效分离是序列分析成败的关 键键。最早采用放射性标记引最早采用放射性标记引 物物，后来采用荧光剂后来采用荧光剂标记标记。 用四甲基若丹明用四甲基若丹明 ( (TetramethylrhodamineTetramethylrhodamine) ) 作作 为荧光剂标记为荧光剂标记DNADNA引物引物，带有带有 这种引物的这种引物的DNADNA片段能在激光片段能在激光 诱导下发出荧光诱导下发出荧光。按照标准按照标准 的双脱氧终止法或化学终止的双脱氧终止法或化学终止 法进行测序反应法进行测序反应，跑跑DNADNA凝胶凝胶 后用计算机检测后用计算机检测。 测序产物的凝胶电泳及识读测序产物的凝胶电泳及识读 基于基于SangerSanger链终止法的链终止法的DNADNA自动化测序自动化测序 毛细管电泳毛细管电泳 激光测序法终止标记激光测序法终止标记系统系统 自动化测序测序流程自动化测序测序流程 毛细管电泳毛细管电泳 毛细管电泳毛细管电泳（CapillaryCapillary electrophoresis,electrophoresis, CECE ） 是以高压直流电场为驱是以高压直流电场为驱 动力动力，在毛细管内使荷在毛细管内使荷 电粒子按淌度或分配系电粒子按淌度或分配系 数进行分离的一种电泳数进行分离的一种电泳 技术技术。 具有分辨率高具有分辨率高、重现性重现性 好好、灵敏度高灵敏度高、快速和快速和 易于实现自动化等优点易于实现自动化等优点。 激光测序法终止标记系统激光测序法终止标记系统 激光测序法终止标记系统是用激光测序法终止标记系统是用 4 4种不同的荧光染料标记不同种不同的荧光染料标记不同 的的ddNTPddNTP。 测序测序反应可以在同一反应管内反应可以在同一反应管内 进行进行，不必分成不必分成4 4管管，反应产反应产 物物按终止位置的碱基不同其按终止位置的碱基不同其 3 3末端带有不同的荧光基团末端带有不同的荧光基团， 被激发后产生不同的荧光被激发后产生不同的荧光，将将 反应产物加样于凝胶的同一加反应产物加样于凝胶的同一加 样孔样孔，电泳分离后电泳分离后，经过经过DNADNA 测序仪分析系统识别测序仪分析系统识别，将检测将检测 将信号不断传送到计算机将信号不断传送到计算机，通通 过软件分析过软件分析，自动读出待测自动读出待测 DNADNA的全部核苷酸序列的全部核苷酸序列 。 自动化测序测序自动化测序测序流程流程-ABIABI测序仪测序仪 荧光标记荧光标记BigDyeBigDye TerminatorsTerminators；美国应用美国应用 生物系统公司拥有专利四生物系统公司拥有专利四色色荧光分别荧光分别标记的起链终标记的起链终 止剂止剂作用作用的四种的四种ddNTPsddNTPs，与四个反应管循环测序与四个反应管循环测序反反 应及应及四个泳道电泳检测的传统双脱氧链终止法相四个泳道电泳检测的传统双脱氧链终止法相比比， 实现了一个反应管完成反应与一个电泳道检测实现了一个反应管完成反应与一个电泳道检测。由由 于于使用了四色荧光分别标记了四种使用了四色荧光分别标记了四种ddNTPsddNTPs，可可按照按照 四种不同荧光来分别识别四种不同荧光来分别识别A A、T T、G G、C C，因此因此，可在可在 一个反应管中完成循环测序反应一个反应管中完成循环测序反应，并并通过一个电泳通过一个电泳 道电泳即可完成测序任务道电泳即可完成测序任务。具有分辨率高具有分辨率高、重现性重现性 好好、灵敏度高灵敏度高、快速和易于实现自动化等优点快速和易于实现自动化等优点。 自动化测序测序自动化测序测序流程流程-ABIABI测序仪测序仪 测序反应测序反应；利用测序酶；利用测序酶 和单向测序引物进行和单向测序引物进行。其核其核 心仍然是心仍然是PCRPCR反应反应。在测序在测序 反应体系中除了一般反应体系中除了一般PCRPCR反反 应所用的应所用的dNTPdNTP外外，还带有还带有 BigDyeBigDye TerminatorsTerminators。通过通过 反应的随机反应的随机终止得到一系列终止得到一系列 含有不同荧光标记的含有不同荧光标记的DNADNA片片 段段。 自动化测序测序自动化测序测序流程流程-ABIABI测序仪测序仪 电泳与结果分析电泳与结果分析 ；染料受测序仪氩离子激；染料受测序仪氩离子激 光激发而发射出特定光激发而发射出特定光谱光谱