3 3 双水相萃取技术

1,3.3双水相萃取技术(Two-aqueousphaseextraction,ATPS),2.3.1概述随着生物化学工程等新型学科的发展，一些含量微小具有生理活性又极有价值的生物物质的分离提纯，成了十分关键的技术课题。生物化学工程的发展在很大程度上依赖于生物分离技术的开拓和进展。,2,例如，生物界已发现的酶有2500种之多，但仅有100多种酶的工业性分离提取有过文献报道。生物工程的产品分离问题，即生物工程的下游技术的开发是极为重要的。,3,生物物质多是有生理活性的，常规的分离技术缺点:处理量小、流程长、易失活、收率低和成本高等。开发新型的生物物质分离技术，使其适应于一定的生产规模，且经济简便、快速高效，是十分迫切的要求。双水相萃取正是作为这类新型分离技术应运而生的。,4,1896年，Beijerinek在把明胶和琼脂或可溶性淀粉混合时发现，两种亲水性的高分子聚合物并非混为一相，而是出现了两个水相的成相现象。这种现象称作聚合物的“不相溶性”。,5,20世纪60年代，提出了双水相萃取技术，利用这类双水相成相现象及待分离物质在此两相间所具有的分配系数，来实现分离提纯的目的。20世纪70年代，进行了双水相萃取的应用性研究。从发酵液中提取各种酶的实验开始的。,6,现在，双水相萃取技术得到了较大的发展，研究及应用领域:各种酶、核酸细胞、蛋白质、细胞器和菌体等的分离。双水相萃取技术是一种具有独特性能、针对性很强的有前途的分离技术。,7,双水相萃取技术(Two-aqueousphaseextraction,简称ATPS)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相,由于被分离物在两相中分配不同,便可实现分离。广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。,2.2的葡聚糖水溶液与等体积的0.72甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。,10,3.3.2双水相体系和双水相萃取,（1）双水相体系双水相的成相现象实际上是由于亲水高聚物之间的不相溶性造成的。绝大多数天然的或合成的亲水性高聚物的水溶液在与第二种亲水性高聚物混合时，超过一定的浓度范围时就能产生两相，两种高聚物则分别溶于互不相溶的两相中，形成所谓的“双水相体系”。,11,由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，使之相互无法渗透，出现分离的倾向。当满足一定的成相条件时，即可分为两相。某些高聚物溶液与一些无机盐溶液相混合时，同样会在一定的浓度下形成双水相体系。即高聚物无机盐双水相体系。,12,常见于生物产物分离的双水相体系有：高聚物高聚物双水相体系聚乙二醇(PEG)葡聚糖(dextran)。高聚物无机盐体系PEG磷酸盐，PEG硫酸盐体系。,双水相系统(aqueoustwo-phasesystem,ATPS),PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol),Kpi=磷酸钾,DX=葡聚糖(dextran),各种类型的双水相体系,15,PEG和Dextran这两种高聚物和水均可无限混溶。当体系的组成在图中的曲线上方时(如M点)，体系就将分为两相，两相的组成和密度均不同。上相(或称轻相)组成用T表示，主要组成是PEG；下相(或称重相)组成用B表示，主要组成为Dextran。相图中曲线TCB称作结线，直线TMB称做系线。十分明显，体系总组成处于系线TMB上时，分相后的上相和下相的组成均为T和B。如果体系的总组成处于结线TCB的下方，则不满足成相条件，体系为均一的单相。,16,（2）双水相萃取及其特点,双水相萃取从原则上讲与一般萃取有共同之处。在满足成相的条件下，待分离物质若在两个水相之间存在分配的差异，就可能实现分离提纯。,17,在常用的双水相萃取体系中，各种细胞、噬菌体等的分配系数或大于l00，或小于0.01，蛋白质(如各类酶)的分配系数在0.1到10之间，无机盐的分配系数则一般在1.0左右。这些不同物质分配系数的差异，构成了双水相萃取分离的基础。,18,双水相萃取技术的优点：(a)适合热敏物质的提取，主要是胞内酶。双水相萃取的主要分离对象一般是具有生理活性的生物物质。这类物质的生理基础是水溶液。,19,采用一般溶剂萃取的方法可能会造成失活而使收率大幅度的下降。双水相体系中水的含量高达70-90，组成双水相体系的高聚物PEG、dextran和无机盐等对于生物活性物质如酶、核酸等无毒害，不会造成生理活性物质的失活和变性。有时，有的物质还可能起到稳定和保护生物活性的作用。,20,(b)根据不同物质在双水相体系中分配系数的差异，双水相萃取可以直接从含菌体的发酵液或培养液中直接提取所需要的蛋白质，甚至可以在不经破碎的条件下操作，直接提取胞内酶。,21,通常的生产工艺中，从发酵液中分离酶一般采用加入大量(NH4)2SO4使酶盐析出来的方法。连同菌体和其它固体物一起过滤，滤饼加热烘干制成酶粉。这类工艺不仅过滤速度慢、效率低，而且失活也比较严重。所制得的酶制剂为含菌体、盐类及其它的粗制酶，总收率一般75。目前采用双水相萃取分离纯化酶，纯化系数(组分在两相中浓度比值之比)为1-8左右，收率在90以上。,22,(c)使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成，双水相萃取的操作与通常的溶剂萃取相似。设备可以选用柱式萃取设备、混合澄清槽和离心萃取器等。（d）便于连续进行、处理量可以较大。,23,双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取;PEG的循环;无机盐的循环。,24,3.3.3双水相萃取技术的研究和应用,生物活性物质在双水相萃取体系中的不同的平衡分配系数是双水相萃取工艺研究的重要内容之一。,25,至今还无法预测复杂体系双水相萃取中物质的相平衡分配系数，所以近年来的研究工作主要围绕直接应用对象，针对生物活性物质在双水相体系中的分配平衡的影响因素开展的。这类研究为确定双水相萃取的工艺条件，开发新的过程打下了基础。,26,影响双水相体系中物质的相平衡分配的因素：,(a)聚合物的种类、平均分子量及浓度(b)成相盐的种类及浓度(c)体系pH值及其它盐的种类及浓度(d)体系所含菌体或细胞的种类及含量(e)体系温度,27,（1）酶的提取和纯化,酶的提取和纯化是双水相萃取中研究最活跃的领域。目前所涉及的酶大约30多种。一些研究的处理规模达到50kg(湿细胞)下表中列举了一些研究和应用的实例。,28,29,在这些体系中，各类酶在双水相体系中主要分配在上相，菌体在下相或界面上。这样就可以实现各类酶和菌体的分离以及各种酶之间的相互分离。,30,分离各类酶的研究开始是采用PEGDextran体系。该体系价格昂贵，无法在大规模的生产上采用。若对该体系中的Dextran选用粗品代替，虽价格下降，但由于粗Dextran的粘度已达PaS级，给工程设计及操作带来很大困难。目前多采用PEG盐体系代替。,31,采用PEGl500磷酸钾盐体系直接从枯草杆菌发酵液中提取-淀粉酶。条件：PEGl500，18(WW)，磷酸钾盐10(WW)，NaCl0.05molL，pH6.5，温度为25。,32,33,酶在上相，菌体分配于下相。一次接触后酶的提取率可达95%左右。加入NaCl之后，有利于体系混合接触后的澄清分相，这一分相过程大约仅在23分钟内即可完成。双水相萃取用于-淀粉酶的分离提取是十分有效的。,34,（2）改变体系盐浓度实现分离提纯,双水相体系中盐浓度的变化往往可能改变待分离物质在两相的分配系数。利用这一影响平衡的因素，可以实现生物活性物质的分离和纯化。,35,利用PEGDextran体系萃取分离核酸时，体系中盐离子浓度大多对其分配系数将产生十分明显的影响。从上图可以看出，由于盐的组成的微小变化会引起分配系数的急剧变化。利用这一性质可以通过改变盐的浓度来实现分离的目的。,36,一些病毒在PEGNaDS(硫酸葡聚糖)双水相体系中的分配系数与体系中NaCl的浓度有很大关系。调节NaCl的浓度，可使病毒几乎全部进入上相或几乎全部进入下相，亦可能使不同的病毒彼此分开。这样就可以实现各种病毒的提取、纯化和反萃取。,37,例如，用PEG60000.5NaDS0.2NaCl0.3M体系，可以使脊髓灰质炎病毒得到80倍的浓缩，活性收率大于90。,38,（3）加入一定量菌体进行分离提取,一些双水相体系中菌体的含量对分离效果有明显影响。在从重组大肠杆菌(E.Coli)碎片中提取人生长激素(hGH)的工艺过程中，PEG60006.6磷酸盐14体系中的菌体含量为1.35干细胞时，保持pH=7，其分离效果最佳。hGH在上相，分配系数达6.4，收率大于60。,39,对于蛋白的纯化系数为7.8，达到萃取平衡的时间仅510秒钟。下图表示了利用这一体系在离心萃取器中进行三级错流实验的结果。该过程处理量为15L3/h，总收率达81，纯化系数为8.5。,40,41,（4）聚合物改性体系的使用,干扰素是合成纤维细胞或小鼠体内细胞的分泌物。将干扰素从其它杂蛋白中分离出来，采用了聚合物改性的双水相休系。在培养基中总蛋白的浓度为1gL左右，而干扰素仅为0.1mgL。采用一般的PEGDextran时，干扰素与主要杂蛋白的分配系数几乎无差别，难以实现分离。,42,将不同的带电基团或亲合基团引入PEG，使之改性，获得PEG的衍生物，可以获得一些新的双水相体系。采用PEG磷酸酯磷酸盐NaCl体系，控制适当的pH值，可使干扰素完全分配于上相，杂蛋白完全分配于下相。干扰素的浓度越高，分配系数愈大，纯化系数可高达350。,43,双水相萃取技术在生物工程产物的分离中具有特殊的优势。利用双水相萃取技术提取葛根素,PEG/(N