课题3　血红蛋白的提取和分离.pptx

课题3血红蛋白的提取和分离,色素的提取和分离原理提取：色素能溶解在无水乙醇中，而不溶于水，可用无水乙醇提取色素。分离（纸层析法）：各种色素在层析液中溶解度不同，溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快，反之则慢，从而使各种色素相互分离。,一、基础知识：蛋白质分离的方法1）凝胶色谱法：又称分配色谱法2）电泳法缓冲液的作用,1.凝胶色谱法,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，具多孔的凝胶就叫分子筛）,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法,（2）概念：,（1）凝胶,3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,总结：大分子经过路程短，移动快；小分子经过路程长，移动慢。,思考：“课题3-血红蛋白的提取和分离”这实验理想的材料又是什么？原因是？,答：哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,二、实验操作实验步骤,血液组成成分,1、样品处理,3、纯化,4、纯度鉴定,2、粗分离,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度,凝胶色谱法进行纯化,注意事项,蛋白质提取与分离的依据蛋白质的物理化学性质差异：1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子亲和力,2凝胶电泳法：,1）原理：,不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、分子形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2）影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,3）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利用相关计算公式算出相对分子量SDS带负电荷多的，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,缓冲溶液洗脱剂（1）作用：（2）配制：,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。,（3）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？,目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。,血液组成成分,阅读思考：血液由_和_两部分组成。血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_。该化合物是由_和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,红细胞,血红蛋白,2条-肽链,2条-肽链,亚铁血红素,步骤一：样品处理之1、洗涤红细胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？,血液100mL,红细胞,血浆,红细胞,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,步骤一：样品处理之2.释放血红蛋白,阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质，有什么用？,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,步骤一：样品处理之3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞混合液,烧杯,有机溶剂血红蛋白,步骤二：粗分离透析血红蛋白,透析的目的是什么？,去除血红蛋白中的小分子杂质,步骤三：纯化凝胶色谱法,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,注意：（1）凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀；凝胶装填时尽量紧密；装填时不能有气泡存在：,（2）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,装填紧密,3.样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样,4.洗脱,5.收集,注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。,3.再调液面,1.调液面,2.加样,3.再调液面,4.洗脱、5.收集,注意事项,1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：沸水浴法，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,Why？,知识总结,血红蛋白的提取和分离,蛋白质的提取分离,样品处理,粗分离,纯化,纯度鉴定,六、课题成果评价（一）是否完成对血液样品的处理观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。（二）凝胶色谱柱的装填是否成功。由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。（三）血红蛋白的分离是否成功如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,（一）旁栏思考题你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。,（二）练习1答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。,（二）练习2答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。,（二）练习3答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。,（二）练习4答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。5答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A、相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B、相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C、相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D、二者根本无法比较,练习巩固,2.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个,B,3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C.将酶或细胞固定在凝胶中D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是()A.使酶的活性最高B.使蛋白质的活性最高C.维持蛋白质所带的电荷D.使蛋白质带上电荷,A,C,5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异,6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）A可采集猪血作为实验材料B用蒸馏水重复洗涤红细胞C血红蛋白释放后应低速短时间离心D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液,A,8.在装填凝胶