分子酶学 (Enzymology)PPT课件.ppt

分子酶学(Enzymology),AboutMyselfWangXiao-Yun(王晓云）Professor,Ph.D.inDepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,CollegeofLifeScienceTel:2656-8430Office:6#430,1,参考书：,袁勤生主编，现代酶学，华东理工大学出版社，2001姜涌明主编，分子酶学导论，中国农业大学出版社，2000王镜岩等主编，生物化学（第三版），高等教育出版社，2002,2,酶可以说是一切生命活动的序幕化学变化，酶决定机体的化学变化。酶学无论从理论上讲或是从应用上讲，都是现代生物学领域的人不能不涉足的一门科学。,3,第一节酶的分离纯化与活性测定第二节酶的结构与功能第三节酶促反应动力学第四节变（别）构酶、同工酶,Enzymology,4,第一节酶的分离纯化与活性测定一、概述Ferment（酵素）Enzyme在酵母中（希腊文）,5,1926年美国“独臂学者”Sumner用全能的右手，花了9年时间，从刀豆中提出了脲酶结晶，并证明具有蛋白质。（不负载任何活性基团的脲酶蛋白质结晶。30年代胃蛋白酶pepsin胰蛋白酶trypsin胰凝乳蛋白酶chymotrypsin结晶并进行了动力学探讨，确立了酶的化学本质推动了蛋白质研究。,6,7,8,9,10,对于酶和生物催化剂概念的认识,Ribozyme抗体酶探针酶人工酶模拟酶克隆酶和突变酶,11,Antibodieshavingcatalyticactivitiescanbegenerated,TheconceptofinducingantibodieswithcatalyticpotentialsrootedinPaulingstransitionstatetheory(1940s);WilliamJenckspredictedtheexistenceofsuchantibodiesin1969;RichardLernerandPeterSchultzgeneratedsuchcatalyticantibodiesin1986;Catalyticantibodieshavebeengeneratedcatalyzingvariouschemicaltransformations,rangingfromsimplehydrolysistoreactionsthatlackphysiologicalcounterpartsorevenarenormallydisfavored.,12,Benkovic,S.J.(1992)“Catalyticantibodies”,Annu.Rev.Biochem.,61:29-54.,Thetransitionstate:ahighenergyfleetingmoment.,Bondbeingbroken,13,Ageneralprocedureforgeneratingcatalyticantibodies.,14,它是研究酶作用机理的有利工具，在抗体酶的研究过程中，可以直接观察到过渡态理论设计抗体酶起到的作用，为酶的过渡态理论的正确性提供了有利的实验证据。抗体酶可以直接作为药物，进入组织，达到治疗效果。它们可能象限制性内切酶切割DNA分子一样，任意切割多肽链，用于治疗艾滋病和各种癌症。,抗体酶发展前景,15,探针酶,既保持高度反应性，又能在DNA中任意选定的区域内进行切割。EDTAFe(II)X探针酶X为探针EDTAFe(II)EBEB与DNA能任意结合，所以在DNA上的切点是随机的。探针酶与限制性内切酶比：切点不够准确。有较大的灵活性，可在任意位置上切割。,16,人工酶模拟酶,人工酶人工合成的具有催化活性的蛋白质或多肽。模拟酶利用有机化学合成的一些比酶结构简单得多具有催化功能的非蛋白质分子。,17,克隆酶和突变酶,克隆酶用基因工程技术生产的酶突变酶用基因定位突变技术修饰天然酶基因，然后用基因工程技术生产该突变基因的酶，被称为突变酶。,18,酶蛋白蛋白酶蛋白质酶RibozymeDeoxyribozyme核糖酶（核酶）核酸酶单纯酶单体酶结合酶寡聚酶恒态酶调节酶组成酶诱导酶胞内酶胞外酶,19,二、当前研究重点1现在人们相继弄清了溶菌酶、蛋白酶、羧肽酶等结构及作用机理，当前对机理方面的研究还不断进行。,20,2酶工程（酶的制备、改造与应用）,化学酶工程（初级酶工程）：自然酶、化学修饰酶、固定酶、人工酶、模拟酶的研究、利用生物酶工程（高级酶工程）克隆酶、突变酶、抗体酶,21,三、酶的分离纯化,建立一个可靠快速的测活方法酶原料的选择酶的提取酶的提纯酶纯度的鉴定,22,建立一个可靠和快速的测活方法,可靠性表现在专一、灵敏、精确、简便测活方法是否经济测活方法越简单，纯化所需等待时间越短，失活越少一个好的测活方法的建立，就是整个纯化工作成功的一半。,23,酶提取方法的选择,生物材料的破碎机械（匀浆）法适合动物、植物、微生物超声波法破碎细胞和细胞器的有效手段，细菌酵母冻融法细胞胞液结成冰晶，使细胞壁涨破，效率不高渗透压法最温和的方法，如红血球破壁，不适于细菌及植物酶消化法利用酶解作用，使细胞壁崩解破碎可加入蛋白酶抑制剂如PMSF（苯甲基磺酰氯）、EDTA、还原剂DTT（二硫苏糖醇）等，保护目的酶。,24,酶提取方法的选择,抽提液由以下几部分组成离子强度调节剂KClNaCl蔗糖pH缓冲剂各种Buffer温度效应剂甘油二甲基亚枫(DMSO)蛋白酶抑制剂PMSFDIFP抗氧化剂DTT巯基乙醇重金属络合剂EDTA柠檬酸增溶剂TritonX-100,25,酶纯化方法的选择,调节酶溶解度的方法根据酶分子大小、形状不同的分离方法根据酶分子电荷性质的分离方法根据酶分子专一性结合的分离方法酶纯化方法选择的一般原则,26,调节酶溶解度的方法,改变离子强度硫酸铵分级盐析反抽提法RNA聚合酶的硫酸铵分级沉淀4255收集3350%饱和度的沉淀。将沉淀再悬浮于42饱和度中，去除某些杂蛋白。改变pH值或温度调节pH至pI，加热去除杂蛋白改变介电常数常用有机溶剂乙醇、丙酮、甲醇,27,根据酶分子大小、形状不同的分离方法,离心分离凝胶过滤透析超滤,28,Ultracentrifugation,29,Gelfiltrationchromatography,30,dialysis,31,Ultrafiltration,Ultrafitrationhasbecomeawidelyusedtechniqueinpreparativebiochemistry.Ultrafiltrationmembranesareavailablewithdifferentcutofflimitsforseparationofmoleculesfrom1kDto300kD.Themethodisexcellentfortheseparationofsaltsandothersmallmoleculesfromaproteinfractionwithahighermolecularweightandatthesametimecaneffectaconcentrationoftheproteins.Theprocessisgentle,fast,andcomparativelyinexpensive.,32,根据酶分子电荷性质的分离方法,离子交换柱层析Ionexchangechromatography层析聚焦法电泳ElectrophoresisinGels等电聚焦电泳IsoelectricFocusing免疫电泳Immunoelectrophoresis,33,Ionexchangechromatography,34,NativePAGESDS-PAGE,35,36,37,IsoelectricFocusing(IEF),IEFcanbedescribedaselectrophoresisinapHgradientsetupbetweenacathodeandananodewiththecathodeathigherpHthantheanode.Proteins,beingamphotericspecies,arepositivelychargedatpHvaluesbelowtheirpIandnegativelychargedabovetheirpI.Itmeansthatwheneveraproteinisinthegradient,itwillmigratetowardsitspI.,38,39,7.0,6.0,5.0,40,1Isoelectricfocusing,pH10,pH4,2SDS-PAGE,Two-dimensionalgelelectrophoresis,41,42,43,44,根据酶分子专一性结合的分离方法,亲和层析Affinitychromatography免疫吸附层析染料配体亲和层析共价层析Covalentchromatography,45,Affinitychromatography,46,Covalentchromatography,47,酶纯度的评价,超速离心电泳SDS电泳等电聚焦N末端分析免疫技术,48,四、酶活力的测定,（一）酶活力（enzymeactivity)酶催化某一反应的能力VV单位时间内单位体积中底物（substrate)的减少量或产物（product)的增加量,49,Enzymeassays,Anenzymeassaymeasurestheconversionofsubstratetoproduct,underconditionsofcofactors,pHandtemperatureatwhichtheenzymeisoptimallyactive.Highsubstrateconcentrationsareusedsothattheinitialreactionrateisproportionaltotheenzymeconcentration.Enzymeactivityiscommonlyexpressedbytheinitialrate(Vo).TheunitsofVoaremolmin-11U=1molmin-11kat=1molsec-1,50,（二）酶活力单位、比活力,1.酶活力单位(1)国际单位U（internationalunit,IU或U）特定条件下，1min内，能转化1mol底物所需要的酶量。1IU（U）=1mol/min(2)Katal单位1Kat=1mol/s1Kat=6107U,51,2.比活力,每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。（U/mg蛋白）比活力越高，表示酶制剂越纯。,52,3.酶促反应的初速度,P,t,t1,酶活力测定：A.最适条件B.初速度,53,P,t,S1,S2,S3,C.底物浓度大,S的选择原则：线性范围越宽越好，但不宜太大,54,t,P,Eo1,Eo2,Eo3,ES,通常情况下，E偏低，10-1210-7mol/LSE，S为10-610-2mol/L,55,4.酶活力的测定方法终点法动力学法酶偶联测定法电化学法,56,终点法（化学反应法）,对于SP反应，间隔一定时间，分几次取出一定体积的反应液，用化学法或物理法立即终止酶反应，然后测定S或P的量。,57,动力学法,1.分光光度法条件：自动记录仪S和P对光的吸收波长不同,L-乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+,NADH的吸收峰340nm，活力O.D340/L,58,59,2.荧光法,条件：S或P