蛋白质--高级生化PPT课件

.,1,蛋白质,高级生物化学,姓名,.,2,CONTENTS,01蛋白质的分离与纯化,02蛋白质分子量的测定,03蛋白质含量的测定,.,3,01,蛋白质的分离与纯化,1、根据蛋白质溶解度不同进行分离：盐析法、等电点沉淀、低温有机溶剂沉淀法2、根据蛋白质分子大小进行分离：透析与超滤、凝胶过滤法3、根据带电性质进行分离：电泳法、离子交换层析法4、根据配体特异性进行分离：亲和层析法,.,4,01,蛋白质的分离与纯化,利用蛋白质理化性质的差异，可以对蛋白质进行分离纯化。由于蛋白质容易变性，选择的方法要尽可能温和，通过多种分离方法的合理搭配，才有可能得到回收率和纯度较高的纯化蛋白质。,.,5,01,1、根据蛋白质溶解度不同进行分离,蛋白质的分离与纯化,1.1盐析法：在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。,.,6,01,1、根据蛋白质溶解度不同进行分离,蛋白质的分离与纯化,1.1盐析法无机盐的选择（NH4）2SO4,MgSO4,Na2SO4,NaCl,Na3PO4等，最常用的是（NH4）2SO4,廉价在水中溶解度大，而且溶解度随温度变化小，低温下也能盐析对大多数蛋白质的活力无损害,.,7,01,1、根据蛋白质溶解度不同进行分离,蛋白质的分离与纯化,1.1盐析法盐析后处理盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去。常用透析法：把蛋白质溶液放入透析袋内（常用玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断更换缓冲液。在低温下进行。也可用葡聚糖凝胶柱层析的办法。,.,8,01,1、根据蛋白质溶解度不同进行分离,蛋白质的分离与纯化,1.2等电点沉淀蛋白质在等电点状态时净电荷为零，颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小。可调节溶液的pH值达到某一蛋白质的等电点使之沉淀。此法很少单独使用，可与盐析法和有机溶剂沉淀法结合使用。,.,9,01,1、根据蛋白质溶解度不同进行分离,蛋白质的分离与纯化,1.3低温有机溶剂沉淀法在蛋白质溶液中，加入与水互溶的有机溶剂后，具有相反电性的离子基团之间的吸引力增加，这就促使它们互相聚集，并沉淀出来。近年来的研究认为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生变化，致使一些原来包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。,.,10,01,1、根据蛋白质溶解度不同进行分离,蛋白质的分离与纯化,1.3低温有机溶剂沉淀法常用的有机溶剂有乙醇或丙酮。如果同时将pH调到蛋白质的等电点使之沉淀，沉淀效率较高，但蛋白质较容易变性，只用于分离某些较稳定的蛋白质。为了防止蛋白质变性，应在低温下沉淀。,.,11,01,2、根据蛋白质分子大小进行分离,蛋白质的分离与纯化,2.1透析与超滤透析法是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖和氨基酸等分开。超滤法是利用高压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子质量的蛋白质。,.,12,01,2、根据蛋白质分子大小进行分离,蛋白质的分离与纯化,.,13,01,2、根据蛋白质分子大小进行分离,蛋白质的分离与纯化,2.2凝胶过滤法（分子排阻层析或分子筛层析）根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于凝胶孔径的大分子由于不能进入胶粒内部，便随着溶剂在胶粒间隙向下移动并最先流出柱外；直径小于凝胶孔径的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。这样不同大小的分子由于所经的路径不同从而得到分离，大分子物质先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。常用的填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。,.,14,01,2、根据蛋白质分子大小进行分离,蛋白质的分离与纯化,.,15,01,3、根据蛋白质带电性质进行分离,蛋白质的分离与纯化,3.1电泳法现在常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以因不同蛋白质所带电荷的差异和大小差异高分辨率地分离或分析蛋白质。在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS）,可以消除蛋白质所带电荷的差异，构成的SDS-PAGE系统是测定蛋白质的相对分子质量最常用的方法。,.,16,01,3、根据蛋白质带电性质进行分离,蛋白质的分离与纯化,3.2离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强。随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质按吸附能力从小到大的顺序先后洗脱下来。,.,17,01,3、根据蛋白质带电性质进行分离,蛋白质的分离与纯化,.,18,01,4、根据配体特异性进行分离,蛋白质的分离与纯化,4.1亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，具有高度的专一性，通常只需经过一步处理，即可将待提纯的蛋白质从很复杂的混合物中分离出来，而且纯度极高。利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种色谱方法。这种特异可逆结合的物质很多，如抗原与抗体，底物与酶，激素与受体等。,.,19,01,4、根据配体特异性进行分离,蛋白质的分离与纯化,4.1亲和层析法亲和层析中一对互相识别的分子互称对方为配体。将称为配体的分子共价结合在层析柱中的固体材料上，混合物流经层析柱时，目标蛋白与配体结合被层析柱中的固体材料截留，而非目标蛋白则不能与层析柱中的固体材料结合。先洗脱除去杂蛋白，再用含游离配体的洗脱剂将目标蛋白替换下来，从而达到目标蛋白的分离与纯化。,.,20,01,4、根据配体特异性进行分离,蛋白质的分离与纯化,.,21,蛋白质分子量的测定,.,22,02,SDS：阴离子表面活性剂，消除电荷因素SDS-蛋白质复合物：全呈长椭圆棒状，消除形状因素。在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。,1、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE法）,蛋白质分子量的测定,.,23,02,在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。,1、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE法）,蛋白质分子量的测定,.,24,02,当蛋白质的分子量间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：1gMr=KbmR式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,1、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE法）,蛋白质分子量的测定,.,25,02,相对迁移率Rm=样品移动的距离/指示染料移动的距离,1、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE法）,蛋白质分子量的测定,.,26,02,1、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE法）,蛋白质分子量的测定,.,27,02,1、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE法）,蛋白质分子量的测定,.,28,02,1、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE法）,蛋白质分子量的测定,注意事项不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。,.,29,02,1、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE法）,蛋白质分子量的测定,注意事项有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。,.,30,02,2、凝胶层析法,蛋白质分子量的测定,实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。,.,31,02,2、凝胶层析法,蛋白质分子量的测定,凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。,.,32,02,2、凝胶层析法,蛋白质分子量的测定,大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。,.,33,02,2、凝胶层析法,蛋白质分子量的测定,如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积V，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为时V，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V+Vi时，出现洗脱峰。,.,34,02,2、凝胶层析法,蛋白质分子量的测定,利用Andrews的实验经验式：lgMr=a/bVe/bVo式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。Vo为外水体积，Mr为相对分子质量，a和b为常数。葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。例如SephardexG-75的分级范围是3000-80000的球形分子。在本实验中用于分离胰岛素（Mr为6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。,.,35,02,2、凝胶层析法,蛋白质分子量的测定,.,36,02,2、凝胶层析法,蛋白质分子量的测定,注意事项各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。,.,37,蛋白质含量的测定,.,38,03,原理：将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定灵敏度：灵敏度低，适用于0.21.0mg氮，误差为2耗时：费时长，慢速，810小时说明：方法复杂，但较确，用于标准蛋白质含量的准确测定,1、微量凯氏定氮法,蛋白质含量的测定,.,39,原理：含2个或2个以上肽键结构的化合物碱性Cu2紫色络合物灵敏度：灵敏度低，适用于1-10mg耗时：快速，20-30分钟说明：用于快速测定，但不太灵敏；不同分子组成的蛋白质显色相似,2、双缩脲法,03,蛋白质含量的测定,.,40,原理：酪氨酸中的酚基+磷钨酸-磷钼酸+碱性Cu2蓝色物质灵敏度：灵敏度高，约5250g耗时：慢速，40-60分钟说明：耗时长；操作要严格计时；颜色深浅随不同分子组成的蛋白质变化,3、Folin-酚法,03,蛋白质含量的测定,.,41,原理：蛋白质中的芳香族氨基酸残基吸收紫外光，且吸收高峰在280nm处灵敏度：灵敏度较高，50-100g耗时：快速，5-10分钟说