2-2 免疫组织化学技术.ppt

第四章，免疫组织化学技术，免疫组织化学组织胚胎学和李淑蕾2012-11-6，(2)冷冻节免疫组织化学染色1。恒冷盒切片：新鲜组织或-80 保存组织切片10-14um；2板材和干燥、密封-20短期保存；3.染色前冷丙酮以4 固定10-20分，PBS 2次5min洗去了；洗去了。必要时细胞膜穿孔。一般是苏木染色核，水溶性密封精制密封。(c)培养细胞免疫细胞化学染色1。固定附着细胞，准备细胞攀登精制。悬浮细胞滴或底漆4%聚甲醛或冷丙酮室温固定10-20min2。易干燥的片剂大于2h，PBS为5min冲洗2次；3.细胞膜穿孔，2，SABC方法与免疫组织化学染色的其他方法相比较，(1) SP方法或SAP方法，(2) EnVisionTMSystems结合多种抗原和抗兔IgG分子与莫令根过氧化物酶形成聚合物，取代传统方法，2，3段，特定1(c)max vision法通过在多肽中结合peroxidase和抗鼠或抗兔IgG分子的多肽中形成polymer分子，可以避免生物素引起的非特异性背景比色。第三，非特异性染色、假阴性、假阳性结果阳性对照组实验阴性对照组实验非特异性染色细胞和间质染色没有差异。或者没有特定部位，无结构染色分布不规则，固定部位在干燥部位、边缘、刀痕、组织折叠处出现均匀染色。(a)抗原表达模式1。细胞质内扩散分布，即细胞质阳性反应；2.核周围细胞质内的分布，其差别在于核轮廓画得很好。细胞质内极限点阳性反应。4.细胞膜线性阳性反应，即使染色大部分淋巴细胞标记也是如此。5.核阳性反应BrdU和女性，孕酮受体蛋白等。部分抗原的阳性表达可能同时出现在细胞质和细胞膜等细胞的其他部分。(b)阳性染色结果定量1。免疫反应阳性细胞数计算每样10个非重叠视野；至少具有3个相同条件的样品；直方图；2 .染色阳性强度和阳性检出率相结合的语音0 2525 5050 75图像分析系统检查阳性结果(见第7章)，4，讨论，(a)实验计划目的建议方法操作过程计划预期结果分划准备3360第1段第2类及效价，(b)抗体稀释度也是最佳抗体浓度，提高染色质量，与周围组织形成良好对比表4-1。确定一抗剂的最佳工作浓度一抗稀释度也可以在特异性染色强度非特异性染色背景强度1333650 10 10 10 13336100 10 10 13336200 10 13336200 11语音控制组1日稀释度13336100和13336200之间找到最佳稀释度。抗体类型(多，单克隆抗体；可用的浓缩抗体)抗体稀释：10毫克/mlBSA和0.05(v/v)%Tween20 0.01molPBS添加额外液体，(c)通过液滴抗体注意事项(组织切片，细胞培养)吸收额外液体；注意：为了避免干燥，不要撞到组织或细胞。注：在组织表面一次性处理一些切片液滴抗体，适合培养细胞。注意：为了均匀分布抗体，轻轻摇晃几秒钟。(4)抗体保存。1.抗体装扮浓缩型-20 冰箱保存。利用抗体稀释剂前涡流均匀化，4，1-2个月3。杀菌和抗体接触的工具消毒(5)对照组非常重要。1，阳性对照组被确认含有检查对象抗原。像检查对象标本一样处理后，应使用免疫群色化、结果各实验证明目标抗原具有一定活性的阳性对照组、染色过程的各个阶段、所用试剂的标准、可靠的染色方法等。特别是检查对象标本为阴性结果的情况下，阳性对照组呈阳性反应，可以排除检查对象标本的假阳性可能性。因此，如果染色结果是阴性，必须建立阳性对照。第二，语音对照组染色为组织切片，知道检查对象抗原不存在。结果是阴性。语音控制在组织内不包含目标抗原的情况下，不应染色，可以排除非特异性染色或交叉反应等引起的“假阳性”结果。第三，空白控制是最常用的对照组，不添加第一段像PBS一样的单性缓冲液，染色结果必须是阴性，说明染色方法可靠，可以排除组织的内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、自发荧光等引起的非特异性发色。第四，替代对照组用与第一段相同的动物非免疫血清替代第一段，用相同的稀释倍数进行比较染色。经证实，检测对象切片的阳性结果不是因为抗体以外的混合血清成分，而是使用的特定抗体和组织细胞内检测对象抗原的特异性反应结果。第五，吸收检查在免疫组织化学染色时，结果必须是阴性，因为相应的纯化抗原和第一抗体反应过度，抗体结合点都与抗原结合等抗原吸收的抗体与组织内抗原不再反应。第六，利用与检查对象抗原无关的同一组织切片的其他结构进行比较。语音反应从声音结构的相同角度相互确认。本身就是对阳性反应的特异性控制。但是在科研工作中只使用这种对比是不科学的。必须像空白控制、替代控制等一样增加，才能承认染色结果。对比实验方法和结果分析，(6)免疫组织化学技术的基本原则，免疫组织化学技术的局限性：组织细胞内测试物质的抗原性；有浓度要检测。检测到的阳性蛋白质是细胞新合成的蛋白质，还是通过细胞间运输的蛋白质，尚未确认。细胞类型和形态组织特异性蛋白GFAP，NF2.识别细胞产品来源的基本原则细胞产品的抗体胰岛素3。决定细胞分化程度的符号蛋白NestinvimentinTublinNF4.神经纤维束及其投射区域的轴向逆行运输5。确认病变特点，发现小病变，肿瘤起源或分化表型，肿瘤分期，治疗和预后，疾病诊断和分类，寻找感染原因等在临床病理学中的应用。AFP，追踪皮层脊髓束(皮质注射)荧光红色，反向追踪(单侧坐骨神经末梢注射荧光红色)，第三种免疫组织化学双染色，要检测两种不同物质在同一样品中是否共存或在同一细胞中共存。1.条件：不同物种的特定抗体双染色；两种抗原最好在不同的部位。两种抗体的抗原修复方法一致。应用两种不同的颜色系统或不同颜色的荧光(HRP和AP或FITC和TRITC)。2 .与单染色不同的地方：原抗原发色后双标准阻断剂或0.05%盐酸，RT，10分钟，防止发色抗原褪色。将37 滴在非免疫血清中