分离科学2010---萃取分离法－2.ppt

1,5.1.5连续萃取技术水相和有机相多次接触提高萃取率。,有机相比水轻,2,有机相比水重,固体样品,3,逆流色谱(CCC)建立在逆流萃取分离的基础之上新型色谱分离技术。逆流色谱可以广义地定义为：(1)任何利用两相不相混溶液的色谱技术；(2)其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管或一系列的腔体中；(3)同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。,4,逆流色谱的发展历史：（1）逆流分溶法20世纪50年代，Craig发明的非连续逆流分溶装置，由一系列的分液漏斗连接而成。缺点：设备复杂，易碎，溶剂体系容易乳化，溶剂消耗量大，分离时间长，很快在60年代被液相色谱所取代。,5,（2）液滴逆流色谱1972年由TokyoRikakikai实现商品化，并广泛用于天然产物的分离。缺点：分离时间长，23天，能够使用的溶剂体系有限，清洗困难，连接处容易渗漏，70年代后期逐渐被淘汰。,典型的装置由300根长度60cm内径1.8mm的玻璃管组成，管柱之间用窄内径的聚四氟乙烯管连接。,6,（3）离心分配色谱和螺旋管式逆流色谱利用离心力场实现固定相的保留，大大提高了两相溶剂的混合效率，允许使用较高的流动相流速，极大地缩短了分离时间。根据固定相保留方式和柱体设计的不同，分为两种，一种是流体静力学平衡体系HSES,一种是流体动力学平衡体系HDES。,7,建立HSES基础上的称为离心分配色谱。它是从DCCC发展来的。,离心力将固定相保留在一系列腔体中。噪声低，绝大部分的两相体系都可以使用。死体积大，不能充分混合，分离效率和相同体积的流体动力学逆流色谱仪差。采用旋转密封接头，易产生渗漏。,Sanki逆流色谱仪,8,建立在HDES基础上的逆流色谱仪是日本YoichiroIto教授于20世纪70年代发明设计的多层螺旋管式离心分离仪。,螺旋管的行星式运动产生变化的离心力场将固定相保留在螺旋管中，并允许流动相快速通过螺旋管并与固定相进行连续高效的混合和分配，分离效率较CPC大大提高。,9,（4）高速逆流色谱和双向逆流色谱Ito教授在行星运动模式和螺旋管柱在支持体上的几何位置找到一种理想的结合状态，发展出一种特殊的同步行星运动模式（J模式），可在短时间内实现高效分离，并可实现两相流体在管内的双向流动。,10,（5）pH区带精制逆流色谱1993-1994年间偶然的发现，即当在酸性物质的样品中加入一定浓度的有机酸时，可以产生一个非同寻常的窄而尖的峰，收集到的样品仅有几毫升。当样品量增大时，每个组分在柱中形成一个高浓度浓缩的等值pH区带，并以一个矩形峰被洗脱出来。在氨基酸、多肽、染料、生物碱等物质的分离中有很好的应用。,11,（6）离心沉淀色谱逆流色谱技术利用两相溶剂在一根开管柱中的逆向流动进行分离，由此Ito在1998年联想到是否可以在开管柱的中间加一层半透膜来实现蛋白质的连续沉淀分离。这种方法为生物大分子以及细胞等生物物质的分离开辟了一个新的途径。,12,2、逆流色谱的应用和发展趋势以制备为主，既适合小分子，也适合大分子。目前的发展趋势：（1）研制更加适合生物大分子分离制备的高速逆流色谱仪；（2）目前该项技术还没有达到大规模工业化生产的程度，在其放大过程中的一些技术问题需要进一步的研究解决。,13,3、逆流色谱的基本原理（1）流体静力学平衡体系（HSES）,14,（2）流体动力学平衡体系（HDES）,螺旋管的行星式运动产生一个强度和方向都变化的离心力场。在离心力高的时候，两相出现倾析，离心力发生逆转时，分开的两相又混合乳化，倾析和混合区域交替地出现在管中。,15,重力场中旋转螺旋管内流体动力分布,2000多年前，希腊数学家阿基米德利用旋转的螺旋结构将河水提升到河岸，他的这种装置叫做“阿基米德螺旋”。（a）重力作用使气泡处在上端、玻璃珠在下端，随着螺旋管的慢速转动，气泡和玻璃珠都向一个方向运动到螺旋管的一端，这一端通常称为首端，另一端称为末端。,16,（b）上图是小体积重相的情况，下图是小体积轻相的情况,17,（c）重相和轻相差不多的情况，螺旋管的旋转使得两相竞争地向首端迁移，不久，两相在首端建立了一种流体动力学平衡，在每一圈管内两相占据几乎相同的体积。任何一相的过量都会被推向螺旋管的尾端一侧。一旦这种平衡建立起来，螺旋管的继续转动，只会使两相在每一圈管内前后混合，两相在螺旋管内的总体分布不变。,18,进一步的研究表明，流体动力学平衡体系中两相的体积比与螺旋管的转速密切相关。,第一区段：慢速区，两相均衡分布；第二区段：临界转速范围，两相建立起单向性流体动力学平衡，重相完全占据首端一侧；第三区段：临界转速后，重相在首端一侧量迅速减小，进一步提高转速又回复两相均衡分布的状态。,氯仿乙酸水体系,19,螺旋管内的两相溶剂分配是一个复杂的流体动力学现象，现在还难以准确用数学公式解释。该分配作用与螺旋管不同部位的离心力有关。,20,1）当转速慢时，离心力可以忽略，重力起主要作用，此时，阿基米德螺旋力同时对两相起作用，竞争性地建立平衡。2）临界范围转速时，由于径向离心力场的加强，使得作用在螺旋管底部的净力场增强，顶部的净力场减弱，在这种不对称力场的作用下，重相向首端的迁移被加速，轻相的迁移受到阻碍，结果在螺旋管内产生一种单向性的流体动力学分配。,21,3）转速进一步增加时，产生一个更强的径向离心力场，使两相溶剂重新分配，重相占据螺旋管的外层空间，轻相占据螺旋管的内层空间，最终导致在整个螺旋管内每一圈均等分布（开始时注入等体积的两相）。,22,J型行星式运动螺旋管内，转速750r/min，靠近中心轴的约1/4区域两相剧烈混合，其余区域两相分层，重相占据外部，轻相占据管内部，沿螺旋管形成一个清晰的界面。每个混合区都向螺旋管的首端行进，行进速率与管柱的公转速率相同。流动相恒速通过固定相时，在管柱内任何部位的两相都以极高的速率进行混合和沉积分配过程，频率可达13次/s。,混合区,沉积区,23,当螺旋管以超过临界速度旋转时，两相溶剂在柱子里面建立一种单向性的流体动力学平衡，这样分别将尾端相从首端引入，首端相从尾端引入，则可以实现双向逆流色谱分离。,24,4、影响逆流色谱的两相分布的物理参数1）疏水性，对于上相为有机溶剂，下相为水相的体系，增强疏水性有利于上相移向首端，下相移向尾端；2）增大两相界面张力；3）减小溶剂的粘度；4）增大两相的密度差；5）加大值（自传半径/公转半径），可以减小公转半径，或者加大螺旋管半径。,25,（4）pH区带精制逆流色谱（pHzonerefiningCCC）Ito在研究高速逆流色谱分离纯化BrAcT3(N-溴乙酰基-3,3,5-三碘代甲腺氨酸）时，观察到产物形成了一个非同寻常的尖峰，其理论塔板数高于2000，而相邻的杂质峰显示正常峰宽，理论塔板数500左右。,26,采用由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-15mmol/L醋酸胺缓冲溶液组成的pH值为4的两相溶剂体系。,27,对收集组分进行pH值测量时发现，pH曲线在溶剂峰后曾出现一段逐渐下降的趋势，然后恰巧在产物尖峰出现的位置急剧增加。样品溶液的质谱分析显示溴乙酸的出现，这是合成反应的副产物。,28,现在将溴乙酸称为“保留酸”，因为它能将分析物在柱中保留更长的时间。近年来的研究表明，很多有机酸都可以单独或者混合作为保留酸。进一步的研究表明，将保留酸加入固定相中会产生在样品溶液中类似的效果。,29,由于其非线性等温线，保留酸形成了一个陡峭的缓行边界，该边界在柱中移动的速度比流动相慢。,当酸性分析物出现在位置(1)时，由于低的pH值形成疏水的中性形式，并且随后进入有机固定相的位置(2)。随着陡峭保留边界迁移，分离物暴露与一个较高pH位置(3)，此时失去质子并且转移到水相(4)，在水相中分析物快速传过陡峭边界重复上述循环。因此，分析物总是被限定在保留酸的边界中伴随着保留酸边界洗脱成一个尖峰。,30,为了将分析物限制在保留边界附近，必须满足一定的条件。,31,该方法允许使用多重的保留酸为间隔剂（spacer），使不同的被分离物以窄峰的形式出现在保留酸的边界上。,32,进样量由1mg增加到100mg，其余条件与前图相同，可以发现有没有保留酸和间隔酸效果相差十分明显。,33,与HPLC的比较：简单，相比不一样，达到同样的分离度需要的理论塔板数少。,34,逆流色谱的应用：制备，特别是中药成分的提取（目前最主要的应用领域）。,35,36,37,长春花生物碱的HSCCC-UV色谱图,38,5.1.6溶剂萃取新技术5.1.6.1液相微萃取技术1996年Cantwell等提出微液-液相微萃取法(MDLPME)。1999年Pedersen-Bjergaard等提出了中空纤维膜-液相微萃取法(HFLPME)，由于中空纤维膜的保护，有机相比较稳定，且不容易被杂质污染的问题，得到了更理想的结果。,39,LPME原理：两相萃取和三相萃取,水-膜-有机相萃取,水-膜-水相萃取,40,两相LPME：待测物质通过被固定在中空纤维膜微孔中不溶于水的有机相进入到中空纤维膜内部的接收相，有机相与接收相相同。富集系数主要取决于待测物质在两相之间的分配系数K接收水。K接收水=C接收C水,41,三相LPME：在中空纤维膜里面的接收相不是有机相，而是另一个水相。萃取效果同样是由分配系数决定：K接收/水=K接收有机K有机/水提高分配系数的数值是得到较好的萃取效果的常用方法，例如调整接收相溶剂的pH值，使得待测物质子化，或者发生络合反应等。,42,LPME的影响因素有机接收相-离子液体pH值-最重要最有效搅拌-摆动搅拌优于磁力搅拌萃取时间-决定于平衡过程样品盐度-盐析降低某些待测物在水溶液中的溶解度，提高萃取常数中空纤维膜材料-多孔憎水性聚丙烯膜，固定有机相溶液，过滤样品溶液中脂肪、蛋白质等大分子或悬浮物杂质，解决了SPME在处理生物样品时经常遇到的问题，一次性使用无残留,43,LPME的应用生物样品血液、尿样、唾液、乳汁等，其待测组分能直接用LPME前处理。环境样品中混合污染物的选择性富集，因为各组分在各相之间的分配系数存在差异，如除草剂、多环芳烃、有机氯农药，硝基苯酚等。,44,5.1.6.2胶体（胶团）萃取萃取物以胶体或胶团形式被萃取。长期以来限于氯仿萃取胶体金，乙醚或氯仿萃取胶体银，硫酸钡等。随着生物化工技术的发展，出现了反相微胶团萃取技术。可以满足不破坏生物物质的活性，且能溶解生物物质并能于水相分离的要求。,45,反相微胶团的形成过程：向非极性溶剂中加入表面活性剂,46,蛋白质的溶解,微胶团中含水量是一个重要参数，W0越大，微胶团半径越大。W0H2O/S,47,主要影响因素表面活性剂种类和浓度：常用AOT琥珀酸二（2乙基己基）酯璜酸钠水相pH：蛋白质带电情况，正电易萃取离子强度其他因素：温度、含水量、溶剂等等,48,49,50,制备含蛋白质的微胶团的方法,慢，蛋白质有机相稳定,快速简单,适合水不溶型蛋白质,51,分离过程,52,5.1.6.3双水相萃取两个水相能发生相分离吗？聚合物的不相容性导致双水相的产生。,空间阻碍作用，相互间无法渗透，不能形成单一的水相。,53,54,55,生物分子在双水相体系中的分配（1）界面张力的作用（2）杜南效应：带电大分子在两相分配时，会在两相产生电位，此即杜南效应（Donnan）,56,57,双水相萃取的应用,58,59,影响分配的主要因素（1）聚合物组成与浓度：影响分配系数K（2）pH：影响蛋白质电荷（3）盐的种类和浓度：影响分配,60,PEG-葡聚糖体系,61,62,双水相萃取的优点（1）含水量高达7090，同时组成两相的高聚物对生物活性物质无伤害。（2）可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取蛋白质，能不经过破碎提取细胞内的酶。（3）易于放大，连续操作，处理量大。,63,5.1.6.3凝胶萃取具有敏感反应与自我调节的凝胶，如外界的pH、温度、电场、离子强度、官能团等的变化引起凝胶的溶涨或者收缩，可以实现选择性萃取或者化学阀的功能。生物体的大部分由柔软而含水分的凝胶组成，例如海参就是利用其独特的凝胶结构从周围环境吸取养分。,64,凝胶的溶涨和收缩是其三维高分子网络中交联点之间链段的伸展和蜷缩的宏观表现。凝胶的性质取决于凝胶网络和溶剂及其相互作用，其体积取决于作用在聚合物网络上斥力和引力的平衡。,65,（1）温度敏感凝胶含有一定比例的疏水和亲水基团，温度的变化可以影响这些基团的疏水相互作用以及分子间的氢键，从而使凝胶结构发生变化。聚N-烷基丙烯酰胺类凝胶聚合物在水后形成的亲水性凝胶具有温度敏感性。高分子凝胶一般有下临界温度（LCST），在该温度下，随着温度降低，凝胶急剧膨胀。在该温度上，随着温度上升，凝胶急剧收缩。,66,N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸叔丁酯共聚微凝胶,微凝胶的DH（水动力学直径）随温度变化曲线,67,（2）pH敏感凝胶聚丙烯酸（PAA）的羧基随着pH变化而离解或非离子化，离解时产生离子，因静电斥力，官能团之间距离增大，大分子网络伸展，反之，大分子网络收缩。,68,纳米凝胶的透光率随pH变化图,聚（N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸）纳米凝胶，低pH，不带电荷，高分子链间与链内形成氢键，收缩，透光率低，高pH，带负电，溶涨，透光率增大。,69,（3）电敏凝胶高分子凝胶网络上带电荷，在直流电场下均会发生凝胶的电收缩。在电场下，带正电的凝胶的对离子带着水分一起从阳极放出，带负电的凝胶水分从阴极放出。凝胶的电收缩是可逆的。凝胶的电收缩速率与电场强度成正比，与水的粘度成反比。单位库仑电量引起的收缩量与凝胶的电荷密度成反比，与电场强度无关。,70,（4）凝胶的筛分作用除了相变特性外，另外一个重要特征是凝胶的筛分作用。因此，凝胶可以用作固相萃取剂，对溶液中大分子物质进行浓缩和净化，以及不同大小分子的分级。,71,（5）萃取用凝胶的要求不溶解不污染溶液溶涨和收缩快、溶涨量大、易与溶液分离对溶质的吸着选择性高强度好、寿命长、易再生,72,（6）凝胶萃取的优点耗能少，萃取剂易再生，设备及操作简单，对物料分子不存在机械剪切或热破坏等。（7）凝胶萃取的应用稀溶液中提取有机物或生物制品，如淀粉脱水，发酵液中抗生素的提取，蛋白质的提取与浓缩，废水中微量有机物的去除等。,73,1热流体进口2机壳3溶液4凝胶颗粒5温度计6进料口7转鼓8挡板9取样口10放液口,凝胶萃取机（天津大学的王宇新等设计制作）,74,碱性蛋白酶的浓缩聚N-异丙基丙烯酰胺温敏凝胶放入碱性蛋白酶溶液中，相变点温度为37.5，温度35以下时溶涨度为25-50倍，滤去凝胶，溶液得到浓缩。将温度调节到37.4时，很快可以干缩到溶涨度接近2倍。,75,固定化半乳糖苷酶的可控酶反应用N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联的N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酰胺的共聚物凝胶，可以用于固定化邻硝基苯基-D-半乳糖苷酶的水解反应。溶涨时，促进底物溶液的吸收与扩散，凝胶内底物浓度增大，促进酶反应，收缩时则抑制酶反应。,76,牛血清蛋白和牛血红蛋白的分离水解淀粉-聚丙烯酰胺接枝共聚物，相变点为pH3.5，会溶涨40-50倍。pH降到3.0时，凝胶收缩。通过凝胶的溶涨，可以分别从0.1牛血清蛋白和0.05牛血红蛋白溶液中浓缩，分配系数分别为16和44。如果采用颗粒度较小的凝胶并使溶液的pH值小于溶质的等电点，则由于吸附等原因，牛血红蛋白可以进入胶相呈红色，可将两种蛋白分离。,77,胰岛素释放设备在这个系统中，多孔膜作为胰岛素存储器与血液之间的支撑介质。含有P(MAA-g-EG)的水凝胶填充于这些孔之间。当葡萄糖浓度较高时，发生葡萄糖氧化酶催化的反应，生成葡萄糖酸，导致周围的pH值降低，