基因工程的工具——酶与载体.pptxVIP

常用工具,分子手术刀限制酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车运载体,基因工程的基本工具,模拟探究基因表达载体的构建,选修三基因工程,观察表格、尝试归纳限制性内切酶的特点,一、限制酶的特点,识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,切割特定序列中的特定位点,在G与A之间切割,EcoRI限制酶的作用,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR），专门识别DNA分子中含有“GAATTC”这样的序列，一旦找到就从G和A之间剪断。,黏性末端,黏性末端,EcoRI限制酶的切割,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,产生黏性末端或平末端,作用结果：,切割对象：,目的基因和运载体,一、限制酶的特点,大肠杆菌结构模式图,DNA,载体需要具备的条件,二.载体的特点,连接磷酸二酯键,三.DNA连接酶的特点,用同种限制酶切割(EcoR),1,三.DNA连接酶的特点,Ecoli连接酶,T4DNA连接酶,只能连接黏性末端,连接黏性末端平末端,练习使用EcoRI剪切目的基因和质粒,思考：1.含目的基因的DNA片段上有几个EcoRI酶切位点？2.含目的基因的DNA片段被EcoRI酶剪切成几段？哪一段是我们所需要的？3.含目的基因的DNA片段与质粒用同种限制酶切割的结果是什么？,2个,3段,会产生相同的黏性末端,中间,材料用具：剪好的纸带（目的基因和质粒）胶带（T4DNA连接酶）饭盒（反应容器）说明：小组成员将自己剪切好的目的基因与质粒放入一个反应容器中再连接。,思考：单纯用EcoR限制酶切割，再连接后的产物有几种？分别是哪些？,（1）目的基因与目的基因连接的产物（2）质粒与质粒连接的产物（3）目的基因与质粒连接的产物,（4）目的基因自身环化的产物（5）质粒自身环化的产物,思考：,如何避免质粒和目的基因的自身环化和随意连接？,用不同限制酶切割目的基因和质粒,材料用具：剪好的纸带（目的基因和质粒）胶带（T4DNA连接酶）饭盒（反应容器）说明：小组成员先将连接好的目的基因与质粒拆开还原,再在原有基础上再次用限制酶SmaI剪切，最后放入一个反应容器中连接。,思考：用两种酶切割目的基因与载体，再连接后的产物有几种？分别是哪些？,用不同限制酶剪切目的基因和质粒,（1）目的基因与目的基因连接的产物（2）质粒与质粒连接的产物（3）目的基因与质粒连接的产物,例1.图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答：（1）将含有目的基因的DNA与质粒该表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有哪些？（2）若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行什么操作？,目的基因载体连接物，载体-载体连接物，目的基因-目的基因连接物,分离纯化,（3）在上述实验中，为了防止目的基因和基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是？（4）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是？接种到含青霉素培养基中，能生长的原核宿主细胞所含的连接产物是？,EcoRI和BamHI,载体-载体连接物,目的基因-载体连接物，载体-载体连接物,1.已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基