定量PCR反应体系优化及实验实例PPT课件

1,基因有限公司市场部黄国庆,定量PCR反应体系优化及实验实例分析,2,荧光定量PCR的定量方法,通用型的荧光染料检测法SYBRGreenI法利用荧光染料（如SYBRGreenI）与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量PCR仪，缺点是专一性不如探针法。特异性的荧光探针法Taqman探针法利用荧光标记的特异性探针和引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于序列专一扩增检测，不过增加了荧光探针的成本。,3,定量PCR实验基本流程,准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA)PCR反应(DNA/cDNA+引物探针+PCRmix)样品编辑(样品名、样品类型)设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线)运行PCR，自动分析数据,4,模板的制备,RNA样品realtimeRT-qPCR是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量PCR步骤。组织或细胞总RNA抽提，以mRNA为模板反转录得到cDNA；以cDNA为模板进行定量PCR.DNA样品组织或细胞的DNA抽提,5,总RNA的质量评价方法,1.检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。R在1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2的）。R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。2.RNA的电泳图谱电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNAsmear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。,6,总RNA的质量评价方法（续）,3.保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000ng的RNA加入至0.5ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70的恒温水浴中,保温1h。另一份放置在-20冰箱中保存1h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。,7,RNA质量判定标准,8,引物的设计原则,上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200bp片段进行PCR扩增。上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复碱基的出现，尤其是要避免4个或超过4个G碱基出现。引物的3端最好不为G或/和C。引物3端的5个碱基不应出现2个G或/和C。避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。,9,探针的设计原则,1.保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。2.Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10。3.确保探针中GC含量在30-80%。4.避免探针中多个重复碱基的出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基5.探针的5端不能为G，因为G碱基可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。6.Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5端离上游引物的3有一个碱基。7.避免探针与引物之间形成二级结构。8.对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。,10,SYBRI染料法实验优化方案,Tips：提高镁离子浓度可以降低SYBRGreenI对PCR反应的抑制作用。我们建议在用SYBRGreenI进行荧光PCR反应时，镁离子浓度要比无SYBRGreenI的普通PCR反应要高出0.5到3mM。,11,Taqman探针法实验优化方案,Tips：2StepRT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为cDNA(1-100ngRNA反转录所得cDNA)模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。,12,引物二聚体的解决（一）,1.引物的设计问题如何判断问题产生于引物的设计？常规PCR实验中能否通过调节退火温度消除引物二聚体常规PCR是否同样存在大量引物二聚体如果常规PCR实验无法消除二聚体，则说明二聚体是由引物设计造成的，需从新设计引物退火温度的问题如果以2为温度梯度，提高退火温度，寻找最佳的退火温度,13,引物二聚体的解决（续）,3.其它因素Mg2+的浓度，以50nM为梯度进行调节；引物浓度过高也会引起二聚体增多，一般使用浓度在50-500nM之间，可降低引物浓度；Sybr-Green的浓度，Sybr-Green浓度越高对扩增的抑制越明显，同样会表现在二聚体较多样品浓度的问题，如果引物设计不是十分完美，则在样品浓度较低时会表现出二聚体，如果必需操作低浓度的样品，则要从退火温度和引物设计上再想解决方法,14,引物二聚体的解决（续）,4.软件操作、程序设置用四步法可以去除引物二聚体，就是在PCR延伸之后加一个介于二聚体Tm与目片段Tm之间的温度,在这个温度采集信号即可，这样二聚体产生的荧光信号就检测不到,Cycle（40）,9415s5920s7220s83采集信号,15,基因组DNA的污染,跨内含子的引物将引物设在两个外显子的结合部，以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应在内含子的前面设计5引物，在内含子的后面设计3引物，以基因组DNA和cDNA为模板的PCR产物大小不一样,达到去除污染的目的2.将RNA提取物用RNase-free的DnaseI处理，DnaseI灭活时RNA可能降解,16,跨内含子设计引物（一）,17,跨内含子设计引物（二）,18,PCR效率对实验结果影响,19,扩增效率低（扩增效率不一致）,扩增效率低，可适当提高体系中Mg2+的浓度，以50nM为梯度降低Sybr-Green的浓度，一般在0.2-1之间调节如果同时扩增两个基因，而扩增效率不一致，请首先明确以下问题：两组引物的退火温度是否一致或接近两条扩增片段长度和GC含量是否一致或接近如果上述两点有一点不能满足就会导致扩增效率不一致，需从新设计引物。特别是在做相对定量分析时，应尽量将两条目的片段的扩增长度和引物的退火温度设计接近,20,实例分析Casebycase,标准品稀释不规范：SYBRGreen(R)I2006-05-16(1)wang.rex；SYBRGreen(R)I2006-06-11(1)fu.rex稀释样品的水污染：SYBRGreen(R)I2006-03-16(2)fan.rexPCR管质量问题：Run2006-07-06FYD.rex；060721-1FYD.rex试剂盒的问题：2005120701香港，DualLabeled试剂盒,21,实例分析Casebycase（续）,荧光阈值的调节：051107-ctgz二聚体的问