微生物工程-第三章-发酵工业培养基设计

第三章,发酵工业培养基设计,培养基：指用于维持供微生物生长繁殖和产物形成所需的一组营养物质和原料。,发酵培养基的作用：,满足菌体的生长促进产物的形成,单位培养基能产生最大量的目的产物；能够使目的产物合成速率最大；能够使副产物合成的量最少；所采用的培养基应该质量稳定、价格低廉、易于长期获得；尽量不影响工业好气发酵中的通气搅拌性能以及发酵产物的后处理。,工业发酵微生物培养基的共性：,发酵工业培养基的基本要求发酵工业培养基的成分及来源微生物的培养基类型发酵培养基的设计原理与优化方法,本章内容：,第一节发酵工业培养基的基本要求,工业培养基：指提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。,提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；提高单位营养物质的转化率；提高单位容积发酵罐的生产能力；提高产物的合成速度，缩短发酵周期；减少副产物和“三废”物质，便于分离纯化；原料价格低廉，质量稳定，取材容易；减少对发酵通气搅拌的影响，降低能耗。,工业大规模发酵的培养基的设计要求：,重点,第二节发酵培养基的成分及来源,一、碳源,1、作用,提供微生物菌种生长繁殖所需的能源及合成菌体所必需的碳骨架；提供菌体合成目的产物的原料。,2、来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃、低碳醇等,3、工业上常用的糖类,葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖会引起葡萄糖效应过量加速菌体呼吸，导致溶解氧不能满足需要,工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标,不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大,糖蜜,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。,不同加工方法对甘蔗糖蜜的影响：,糖蜜使用应注意除杂：,除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵,有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）,预处理：澄清脱钙脱除生物素,例：柠檬酸发酵,有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）,预处理：黄血盐（亚铁氰化钾：作为除铁剂）,淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格低廉，可以解除葡萄糖效应,例：地衣芽孢杆菌生产-淀粉酶,碳源对生长和产酶的影响：,碳源细胞量-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2,李江华，无锡轻工大学学报，2004,(1.5g麸皮),嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响,结果：各种碳源相差不大,推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型,苏勤，林业化学与工业，2004,、油和脂肪,油、脂肪,甘油脂肪酸,CO2H2O,ATP,脂肪酶,氧气,供氧要充足，否则会使有机酸积累，引起pH下降,常用：豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等,发酵过程中会使pH上升CH3COONaO2CO2+H2O+NaOH常用：乳酸、柠檬酸、乙酸,、有机酸及其盐,正烷烃（C1418)、乙醇、甲醇等菌体收、得率较高,、烃和醇类,二、氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,1、无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：吸收利用快（速效氮源），常引起pH的变化如：(NH4)2SO42NH3+2H2SO4NaNO3+4H2NH3+2H2O+NaOH,生理酸性物质经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源（如硫酸胺）；生理酸性物质经微生物生理作用（代谢）后能形成碱性物质的无机氮源（如硝酸钠）；,所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH,正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用！,毛霉产蛋白酶的研究：,陈涛，中国酿造，2004,初始pH的影响:,pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大,初始pH对毛霉产蛋白酶活的影响,无机氮源的影响：,硫酸铵硝酸铵硝酸钠脲,毛霉产蛋白酶的研究：,陈涛，中国酿造，2004,2、有机氮源,来源：廉价原料（花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等）。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。,例玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）较多的乳酸、苯乙酸硫、磷、微量元素等,有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,例：蛋白酶的生产,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是研究重点,三、无机盐及微量元素,1、作用：各种不一样,2、来源：C、N源，以盐的形式补充,3、用量：根据具体的产品，以实验决定,4、使用时应注意：,对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑。,例：青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml发酵罐必须进行表面处理,B.使用时注意盐的形式（pH的变化）,例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，pH对酶活的影响：pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟,四、水,对于发酵工厂，洁净、恒定的水源至关重要。水源质量的主要考虑参数：pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻。对于常规发酵，也需要可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。,五、生长调节物质,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,1、生长因子,有机氮源是这些生长因子的重要来源,概念：指加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大提高的一类化合物。,2、前体,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,作用：前体有助于提高产量和组份,用量：按分子量衡算（考虑转化率）,例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸？青霉素=6000*0.6（微克）=36mg/ml苯乙酸=（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%,用法：前体使用时普遍采用流加的方法前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利例：苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%流加也有利于提高前体的转化率前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化；,指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,3、产物促进剂,促进剂提高产量的可能机制：本身是酶的诱导物；是表面活性剂；对酶的表面失活有保护作用；是沉淀或螯合有害的重金属离子。,第三节微生物的培养基类型,培养基可按其组成物质的纯度、状态、用途分类,一、按纯度,合成培养基:原料其化学成分明确、稳定,适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律,培养基营养单一，价格较高，不适合用于工业生产,天然培养基:采用天然原料,原料来源丰富、价格低廉、适于工业生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,M培养基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10g,pH7.0,YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g,NaCl10g，pH7.2,培养大肠杆菌常用两种培养基,二、按状态,固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8%,主要用于微生物的鉴定。液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。,斜面培养基种子培养基发酵培养基,三、按用途（从发酵生产应用考虑）,可分为：,要求：能使菌体生长快，产生孢子数量大、质量好，且不会引起菌种变异。对放线菌或霉菌产孢子培养基：C、N源不宜多，否则只长菌丝，少长或不长孢子；无机盐浓度要适当控制，否则会影响孢子的颜色和孢子量。,1.斜面培养基,要求营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些；培养基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子萌发生长；pH要稳定；最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少量发酵合成期才大量需要的物质。,2.种子培养基,目的：获得高产量的发酵产物。要求：营养丰富完全，有利于产物合成；不能大量加入快C、N源，应和慢C、N源相结合；在产物分泌期间，pH稳定；加入适量合成所需的前体等物质，定向发酵；采用中间补料，以提高发酵单位；原料的考虑成本问题。,3.发酵培养基,第四节发酵培养基的设计原理与优化方法,培养基设计的重要性：对现存发酵培养基引用吸收的必要验证；对菌种发酵条件认识的必需途径；发酵技术建立的一个重要步骤；发酵生产成本控制的重要渠道。,一、发酵培养基的设计原理,确定培养基的组成成分确定各组分之间的最佳配比,设计目的：,目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,培养基组分及浓度选择需考虑的因素：,菌体的同化能力代谢的阻遏和诱导合适的C、N比（1000.22.0）pH的要求,重点,二、发酵培养基的优化方法,培养基设计与优化一般过程：,根据以前经验，初步确定可能的培养基组分单因子优化实验确定最为适宜的各组分及最适浓度多因子实验进一步优化,重点,（1）理论转化率与实际转化率,理论转化率：指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。,实际转化率：指实际发酵过程中转化率的大小,如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个重要目标！,例:如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为C6H12O62C2H5OH+2CO2葡萄糖转化为酒精的理论得率为2*46Y=0.52176,（2）实验设计,培养基成分的含量最终都是通过实验获得的,合理的实验方法,正交实验设计多因子实验：响应面分析,单因子实验,方法,结果,培养基优化的基本方法,类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化,郭秒,食品与工业发酵，2004,类胡萝卜素的作用：色素、营养保健,原培养基:,初步确定可能的培养基成分(以碳源为例),通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例),考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源,进一步：乙酸钠的浓度2%比较好,结果：,碳源：乙酸钠0.2%,氮源：氯化铵0.2%酵母膏0.03%,无机盐:复合无机盐0.05%,正交设计确定优化的配方,改进后培养基,原培养基,改进后培养基的发酵结果,响应面优化培养基配方：,1、部分因子实验（FFD）初步筛选主要影响因子2、最陡爬坡实验确定主要影响因子最适取值范围3、中心组合实验（CCD）确定最佳实验点,响应面法优化培养基,摇瓶水平到反应器水平的优化配方,摇瓶、反应器培养基研究的两个层次,摇瓶培养基设计的第一步,反应器最终的优化的基础配方,例：青霉素发酵,发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%轻质碳酸钙1%,发酵罐：葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%，补加硫酸、前体等,摇瓶发酵培养基和罐的基础培养基差别很大,摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础,发酵罐：反应器水平,可以得出最终优化的基础配方,pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究,培养基设计时注意的一些相关问题,原料及设备的预处理,原材料的质量,发酵特性的影响,培养基优化与培养条件优化紧密结合,（1）确定培养基配方；（2）选择培养基配制原料；（3）原料预处理（除杂、粉碎或转化）；（4）原料组分的称量；（5）各部分原料按次序加水混合；（6）必需的发酵理化状态调整；（7）培养基灭菌；（8）投入发酵使用。,培养基的配制过程：,1.固体培养基中需要加入琼脂的目的是（）A为菌体提供碳源B为菌体提供氮源C使培养基保持水分D使培养基凝固2实验室常用的培养细菌的培养基是（）A牛肉膏蛋白胨培养基B马铃薯培养基C高氏一号培养基D麦芽汁培养基,思考题：,3下列关于生长因子的说法，不正确的是（）A是微生物生长不可缺少的微量有机物B是微生物生长不可缺少的微量矿质元素C主要包括维生素、氨基酸和碱基等D是微生物自身不能合成的4.下列哪种物质是发酵生产时培养基中的生长因子()A.淀粉B.维生素C.蛋白质D.糖蜜,5.苯乙酸在青霉素G发酵培养基中的作用是（）A、诱导剂B、氮源C、前体D、消沫剂,6下列属于微生物不可缺少的微量有机物的是（）牛肉膏蛋白胨氨基酸维生