乳腺癌基因治疗研究进展.ppt

乳腺癌基因治疗的研究进展theresearchprogressofhumhanbrestcancergenetherapy，曾是赵军分子生物学系，2、乳腺癌是女性健康严重的恶性肿瘤。 国际抗癌协会(IARC )发表的统计资料显示，乳腺癌在世界许多地区的发病率呈逐年上升趋势，成为目前女性发病率最高的恶性肿瘤。 第一节乳腺癌基因治疗的研究背景，3、乳腺癌危险因素： (1)发育、激素水平相关的(2)营养膳食相关的(3)家族史和基因修饰基因相关的a .抑癌基因失活b .癌基因异常(4)其他危险因素，4、乳腺癌肿瘤治疗模式、手术、放疗、化疗、激素治疗为肿瘤这些治疗方法很难完全消灭肿瘤细胞，易损伤正常组织，尤其是机体免疫系统。 目前肿瘤的基因治疗越来越受到重视，显示了良好的应用前景。 5、乳腺癌发病的分子机制主要有两个方面：第一、基因表达异常。 最常见的基因表达异常是cyclinD1、neu和ras、c-myc或Wnt-1原发癌基因过度表达。 第二，基因结构发生变化。 包括染色体缺损和基因扩增。 第二节乳腺癌自杀基因治疗的概念、内容和特点，6、brestcancergenetherapyusingtumoursuppressorgenes、clinicaltrialsofp 53 genereplacementhavehadlimitedsuccess； pertenserpresserveraticpotinandeducesnevascularization，7，Prospects， tatirisityiontinducegrowtharrestosinstreationsofp 53 andbinecessryclinicaltrialsofsecond-generationconolyticvirusescombinations nes、8、乳腺癌抗体治疗、单克隆抗体Herceptin (荷西汀)在HER-2/neu原癌基因的人/小鼠上结合单克隆抗体，与细胞表面的erb-B2受体结合，抑制乳腺癌细胞的生长，抗体通过细胞产生细胞毒作用。 免疫基因治疗是指在基因水平上，通过诱发或强化肿瘤细胞表面对肿瘤相关抗原(TAAs )的生物体内特异性免疫反应，调动宿主免疫系统识别和破坏癌细胞。 乳腺癌组织表达her2/neu (cer2)、MACG-1、MUC-1等多种TAAs，机体对这些TAAs发生特异性体液和细胞免疫反应。 10、编码促免疫反应细胞因子的基因直接在体内转染肿瘤细胞，或在体外转染肿瘤细胞，肿瘤细胞在放射线照射下失活后，自行移植到体内增强免疫反应。 包括IL-2、IL-12、干扰素、粒细胞巨噬细胞凝集刺激因子(GM-CSF )等。 采用特异性靶抗原作为疫苗对肿瘤的免疫反应是有效的。 目前用于乳腺癌免疫治疗的特异抗原有HER-2、CEA、MAGE-1、MUC-1等。 应用基因工程修饰这些编码抗原的基因后，克隆到逆病毒载体，移植到体内或体外采用基因工程，克隆这些抗原的不同抗原簇，产生不同抗体，筛选出可抑制肿瘤细胞生长的抗体。 己烯(Herceptin )是c-er-2胞外区不同抗原团簇的人单克隆抗体。 有效抑制c-er-2下游信号转导，抑制乳腺癌细胞生长。 特异性靶抗原的免疫治疗、抑癌基因治疗、野生型p53基因通过调控视网膜母细胞瘤基因具有调控细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用。 但是，乳腺癌细胞的p53因易突变而失活，影响了p53基因治疗乳腺癌的应用。 乳腺癌家族中抑癌基因BRCA1常存在突变，发现表达过低。 乳腺癌动物模型采用安装BRCA1的抗病毒载体，直接注入肿瘤内，可抑制晚期乳腺癌胸壁转移瘤的生长。 将化学基因治疗、多药耐药基因(MDR )等耐药基因移植到造血干细胞中，自体输血增加化疗药物剂量，增强疗效，不影响机体造血系统。 Cowan等人提取4例乳腺癌患者造血细胞，体外转染MDR基因，再用大量化学药物杀死可能污染的肿瘤细胞，然后将转染的造血细胞移植到MDR中。大剂量化学药物给药后，3例患者移植细胞均检测到MDR表达，转染MDR的细胞存活率与骨髓抑制成反比，未发生严重不良反应。 药物前体活性基因治疗(GPAT )利用正常与肿瘤细胞之间某些基因转录的差异，可选择性驱动肿瘤细胞内导入的惰性化疗药物前体转化为活性代谢产物，特异性杀伤肿瘤细胞。 氟脲类药物对乳腺癌有杀伤作用，而5 -氟代胞苷(5-FC )作为药物前体对细胞无杀伤作用，是嘧啶脱氨酶的转化，具有代谢活性5-FU(5-氟尿嘧啶)杀伤肿瘤细胞的能力。 从化合物中筛选出维生素B17这一化合物。 维生素B17通过竞争性地结合ATP，不影响蛋白质的表达，能够不可逆地抑制c-er-2活性。 动物实验表明，维生素B17能缩小c-er-2过量表达的乳腺癌肿瘤。 显性基因敲除治疗，显性癌基因敲除，减弱肿瘤生长和浸润能力。 研究表明，myc反义核酸对雌激素依赖型和非依赖型乳腺癌细胞有抑制作用，转化生长因子(TNF-)反义信使RNA可抑制雌激素诱导的雌激素反应性乳腺癌细胞增殖。 抗血管生成基因治疗、抗血管生成基因的因子包括内皮抑素、血管紧张素和干扰素。 根据肿瘤与正常内皮细胞之间基因表达的差异，选择性抑制肿瘤内皮细胞中异常基因的表达，抑制肿瘤血管的生成，达到了治疗肿瘤的目的。 最强的血管生成细胞因子是VEGF。 反义核酸、可溶性VEGFR、核酶、抗VECF单克隆抗体及受体酪氨酸激酶(RTK )抑制剂用于抗肿瘤血管生成的基因治疗。 18、自杀基因治疗乳腺癌的作用机制、病毒载体、病毒蛋白、自杀基因、药物前体、毒代谢物、乳腺癌细胞、直接杀伤癌细胞，以旁观效应杀伤癌细胞、19、自杀基因hstk编码胸苷激酶，在细胞内、 自杀基因hstk磷酸化核苷类似物GCV，再代谢为三磷酸GCV，抑制细胞DNA聚合酶，影响DNA合成，导致细胞死亡，达到清除肿瘤的目的。 20、有问题吗？ 目的基因表达不受调控，存在过度表达或不适当表达，尤其是插入基因影响毒性基因或生物体时，不仅不利于疾病的治疗，而且可引起致命副作用。 21、特异性转录调控因素使治疗基因在肿瘤细胞中正确有效地表达，提高治疗基因表达受体外因素的调控，提高基因治疗的有效性和调控性是基因治疗领域的重要问题。 第三节乳腺癌自杀基因控制治疗，22，乳腺癌基因治疗的控制因素，1 )乳腺癌相关基因： erbB-2，Muc-1，p53，BRCA1，BRCA2，nm23，p16等2 )组织特异基因：雌激素反应元件(ERE )，人乳白蛋白3 )缺氧反应元件(HRE )等。 23、Tet基因表达调控系统、Tet系统利用大肠杆菌抗四环素操作子的阻断和阻止作用调控基因表达，使基因表达受四环素的精确调控。 Tet激活系统(Tet-On )突变的Tet抑制蛋白与VP16活性区融合表达rtTA，存在柔红霉素时，rtTA与tetOp结合激活靶向转录。 24、调节Tet-On乳腺癌细胞株hstk表达和体外调控治疗作用的实验研究，25、重组逆转录病毒载体pRevTRE/tk的构建、PCR扩增获得hstk基因DNA片段、设计引物时，引物TK1的5中含有BamH酶切位点、引物TK226、重组逆转录病毒载体pRevTRE/tk鉴定、M12、图1重组质粒pRevTRE/tk的酶切检测结果m :DNA/hinddnamarkerlane 1: prev tre/hstk/bamhihind； lane 2: prev tre/hsvtkplamiddna，图2重组质粒pRevTRE/tk的PCR鉴定结果m:100bpdnaradermker； lane 1: pcrproductwithprimertk1andtk 2； 在lane 2: pcrproductwithprimertk3andtk 4，27，MCF-7细胞转染实验，MCF/TRE/tk/Tet-On，28，Tet-On基因控制系统中，发挥其作用所必需的两个组成部分： TRE元件和re 转染含有TRE元件和目标基因的宿主细胞后，用含有rtTA的质粒转染，转染2次构建细胞株。 29、MCF/TRE/tk/Tet-On细胞hstk基因表达，图3ox是调节MCF/TRE/tk/Tet-On细胞hstk基因表达的M:100bpDNAMarker； Lane1-6表示Dox浓度为0，0.1，1，10，100，1000g/ml时细胞HSVtk基因的表达，为30， MTT法测定分析MCF/TRE/tk/Tet-On细胞存活率，图4dox浓度为1g/ml时，MTT法测定GCV浓度不同时MCF/TRE/tk/Tet-On细胞存活率的变化，31 Dox浓度对MCF/TRE/tk/Tet-On细胞生长的影响，图5GCV ml时，不同浓度Dox对MCF/TRE/tk/Tet-On细胞存活数的影响，32，旁观者效应，表1MCF/TRE/tk/Tet-On细胞的旁观者效应克隆数，33， 自杀基因通过将可控制乳腺癌动物模型建立的HSVtk基因和表达调控系统Tet-On的乳腺癌细胞MCF/TRE/tk/Tet-On直接接种到SCID小鼠，建立可控制自杀基因乳腺癌动物模型，自杀基因体外调控机制34、SCID小鼠体内肿瘤和治疗前后肿瘤大小的变化，图6乳腺癌细胞MCF/TRE/tk/Tet-On接种SCID小鼠后NS组、GCV组、gcdox组SCID小鼠肿瘤体积的变化，35、SCID小鼠肿瘤组织病理学观察，图7三组(NS组、gcdox组、SCID小鼠肿瘤组织病理学观察) GCV治疗组Dox GCV治疗组，36，RT-PCR检测SCID小鼠肿瘤组织hstk的表达，M123，图8RT-PCR检测组SCID小鼠肿瘤治疗15后hstk的表达M:100bpMarker； 1.GCV治疗组2.Dox GCV治疗组3.NS对照组37，研究背景，逆转录病毒载体用于exvivo基因治疗，实际感染效率低。 原因：一，感染分裂细胞二，获得病毒滴度低三，病毒半衰期短，移动距离有限，一个半衰期内多数病毒无法到达靶细胞。 逆转录病毒介导的HSVtk基因表达和提高逆病毒滴度的初步研究38，逆转录病毒的纯化，将初步浓缩的病毒液冷冻干燥除去更多水分，用小缓冲液(DMEM )溶解后在-70冷冻保存，得到浓缩病毒液。39、产毒PA317阳性细胞克隆的筛选培养，图14的微乒乓感染pRevTRE/HSVtk、pRevTet-On、pRevTRE载体的PA317细胞经赤霉素b、G418筛选2周的抗性克隆(100 )、40， 不同培养时间与重组病毒滴度的关系图9不同培养时间克隆PA317细胞产生重组病毒滴度的测定，41，不同丁酸钠浓度与重组病毒滴度的关系，05101520， 图10不同丁酸钠浓度下克隆PA317细胞培养30h产生重组病毒滴度的测定、42、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有无表达病毒蛋白质、图11的克隆PA317细胞上清SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳m :蛋白质Lane1:pRevTREDNA转染至PA31730h后的细胞上清； Lane2:pRevTRE/tkDNA转染PA31730h后的细胞上清，43、PCR检测克隆的细胞上清中有无HSVtk基因插入片段，图12转染PA317细胞上清PCR检测HSVtk基因M:100bpDNA标准物Lane2:pRevTREDNA转染PA31730h后的细胞上清，44、RT-PCR检测感染逆转录病毒浓缩液的MCF-7细胞中的hstk基因的表达，-actin420bp、图13感染逆转录病毒浓缩液的MCF-7细胞中Lane1:MCF-7细胞Lane2:感染重组逆转录病毒液的MCF-7细胞、45、产毒细胞系分泌重组病毒的PCR鉴定、图15pRevTRE/tk、pRevTet-On、pRevTRE乒乓转移的PA317细胞上清PCR扩增目标基因m:100 BPR 1 :转染1:prevtre/hstk质粒载体的克隆PA317细胞上清； 转染pRevTet-On质粒载体的克隆PA317细胞上清； 转染pRevTRE质粒载体的克PA317细胞上清、46、重组病毒感染MCF-7细胞及阳性克隆细胞株的筛选，图16重组病毒感染MCF-7细胞后筛选的赤霉素b和G418抗性克隆(100 )， 可控重组逆转录病毒在乳腺癌基因治疗中的实验研究，制备了47种重组逆转录病毒RevTRE/HSVtk和RevTet-On，通过逆转录病毒感染靶细胞，使Tet-On基因调控系统的反应元件TRE和rtTA调控元件同宿主48、病毒感染细胞基因组DNA的提取和酶切，图17病毒感染细胞基因组DNA的提取和酶切图m:lambda DNA/ecorihindDNA marker； 1 :抗病毒RevTRE/HSVtk和RevTe