转基因成分PCR定性检测技术

种子转基因成分PCR定性检测技术,1、转基因技术简单介绍,2、转基因作物现状,3、转基因成分PCR定性检测技术,种子转基因成分PCR定性检测技术,转基因技术简单介绍,什么是转基因,植物转基因方法,转入什么基因,什么是转基因,转基因技术简单介绍,将不同来源的DNA分子进行重组，克服了天然物种生殖隔离的屏障，将具有某种特性的基因分离和克隆，再转接到另外的生物细胞内。转基因可以按照人们的意愿使生物体的遗传性状发生改变，创造出自然界中原来并不存在的新的生物功能和类型。,转基因生物,是指遗传物质基因被改变的生物，其基因改变的方式是通过转基因技术，而不是以自然增殖或自然重组的方式产生。简称：GMOs,喷施草甘膦前,喷施草甘膦后返回,抗草甘膦油菜RT73,转基因技术简单介绍,非转基因油菜,转基因技术简单介绍,中国培育的转基因抗虫水稻Bt63,植物转基因方法,转基因技术简单介绍,农杆菌介导转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。,基因枪介导转化法利用火药爆炸或高压气体加速(这一加速设备被称为基因枪)，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。,转基因技术简单介绍,花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于20世纪80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。,调控元件：启动子、终止子、内含子、增强子等；标记基因：hpt基因，NptII基因，GUS基因等；目的基因：抗虫性状的cry系列基因、抗除草剂性状的EPSPS基因、PAT基因、BAR基因等。,转入的基因,转基因技术简单介绍,转基因作物现状,转基因作物的研究最早始于20世纪八十年代，1983年全球第一例转基因植物在美国问世，1987被允许进入田间鉴定试验，1992年开始大田产量试验，1995年完成安全性评价研究，1996年在美国最早开始商业化生产，当年种植面积174万公顷。,转基因作物现状,据“农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）”2011年3月7日发布的年度报告称：2010年，共有29个国家种植了1.48亿公顷转基因作物；1996年到2010年，全球转基因作物累计种植面积超过10亿公顷。,2010年中国种植转基因作物面积达350万公顷，排名世界第六，其中转基因棉花330万公顷，其余是转基因木瓜，转基因番茄，转基因辣椒等。截止目前，中国共批准发放7种转基因植物的农业转基因生物安全证书，耐贮存番茄、抗虫棉花、改变花色的牵牛花、抗病的辣椒、抗病的番木瓜、抗虫水稻、转植酸酶基因玉米。,转基因作物现状,转基因作物现状,转基因作物现状,转基因作物现状,转基因成分PCR定性检测技术,转基因检测方法分类,转基因成分PCR定性检测,DNA提取,PCR扩增,电泳及分析（琼脂糖凝胶电泳、结果分析、异常情况分析）,生物化学测定法,蛋白质分析法,PCR测定法（通用元件筛选、基因特异性检测、构建特异性检测、品系特异性检测）,转基因检测方法分类,转基因成分PCR定性检测技术,生物化学测定是通过检测转基因作物某一特性的缺失或存在，来判断样品是否为转基因产品。根据检测目标可以分为检测外源抗性基因和检测外源标记基因两种。,生物化学测定法,蛋白质分析法又称免疫分析法，是检测通过基因修饰获得的外源蛋白质最常用的方法。该法利用抗体与抗原的特异性结合来检测外源蛋白的存在，主要分为酶联免疫分析法和侧向流动免疫试纸法两种。,蛋白质分析法,PCR检测法,PCR检测法是目前检测转基因种子最普遍的方法，根据检测策略可分为通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测和品系特异性PCR检测四类(见图1)；按检测原理则可将其分为定性PCR检测和定量PCR分析两类。,转基因成分PCR定性检测技术,1)通用元件筛选PCR检测:主要以转基因产品的通用元件和标记基因为特异性扩增片段，例如CaMV35S启动子、NOS终止子等通用元件以及NPT,Hpt,GUS等标记基因。由于相同的通用元件和标记基因经常被用于多种转基因产品的研究与生产中，因此该法只能用于转基因产品检测的初步筛选。至于导入了何种基因，还需作进一步的鉴定。,2)基因特异性PCR检测:以插入外源基因的特异性DNA片段作为目的检测片段，例如常用的Cry1Ac,CrylAb和CP4-EPSPS等基因。目前商业化种植的转基因产品的外源目的基因基本都己建立了这种检测方法。但是，该法不能特异性的区分具有相同农艺性状的转基因植物及其品系。,转基因成分PCR定性检测技术,3)构建特异性PCR检测:以外源插入载体中两个元件连接区的DNA序列为检测目标，该法具有相对较高的特异性，目前商业化种植的各种转基因植物基本都己建立这种检测方法。但是由于转基因外源表达载体可能以一个、两个或者多个拷贝的形式插入到不同或者相同的植物基因组中，从而形成具有相同农艺性状的不同转基因品系，因此构建特异性检测方法不能特异性的区分具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系。,4)品系特异性PCR检测:以外源插入载体与植物基因组的连接区序列为检测目标。由于每一个转基因植物品系都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并目连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。,转基因成分PCR定性检测技术,转基因成分PCR定性检测技术,掌握检测对象的基本信息。如DNA或蛋白水平检测，要了解转基因植物插入的DNA序列信息及表达情况；须有针对特定核酸或蛋白的检测方法。如DNA水平检测的引物、探针和蛋白水平检测的抗体等；检测必须使用标准参考物质。作为转基因成分检测中的对照、用于制作转基因定量分析的标准曲线、不同实验室之间结果比较的重要参考。,转基因成分PCR定性检测技术,检测前准备,转基因成分PCR定性检测技术,转基因检测工作流程,转基因成分PCR定性检测技术,检测步骤,DNA提取PCR扩增电泳分析,转基因成分PCR定性检测技术,转基因成分PCR定性检测技术,DNA提取,转基因成分PCR定性检测技术,转基因成分PCR定性检测技术,PCR扩增,1、引物：用TE缓冲液（pH8.0）或双蒸水将引物稀释到10mol/L。引自农业部953号公告62007,转基因成分PCR定性检测技术,2、设置对照在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。设置两个阴性对照：用非转基因玉米材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；设置两个阳性对照，用转Bt基因玉米含量为1%的玉米DNA作为PCR反应体系的模板；设置一个空白对照：用无菌重蒸水作为PCR反应体系的模板,转基因成分PCR定性检测技术,3、反应体系制备1）体系制备。一组样品(包括样品/阳性/阴性/空白对照)的体系要一起制备，每个试样2次重复。取1.5ml离心管，按照表A.2给出的顺序依次加入试剂。在配制反应体系时所有的试剂都应置于冰上。用移液器轻轻混合反应体系并轻微离心！,转基因成分PCR定性检测技术,PCR反应体系（不包含模板DNA）,转基因成分PCR定性检测技术,2）分装：根据需扩增的样品数量取0.2ml离心管，分别编号，将配制好的反应混合物分装在0.2ml离心管中，每管24l；然后在每管中加入DNA模板，盖上盖子，弹去气泡，短暂离心使液体置于离心管底部。3）加入DNA模板。在上面的分装液中加入1l25ng/lDNA模板。轻轻振荡并轻微离心，再加约50L石蜡油（有热盖设备的PCR仪可不加）。,转基因成分PCR定性检测技术,4、PCR反应程序离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。反应程序为：95变性5min；进行35次循环扩增反应（94变性1min，56退火30s，72延伸30s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长）；72延伸7min；4保存。（SPS、35S、NOS、Bt均使用相同的反应程序。）反应结束后取出PCR反应管，加入约3l的加样缓冲液，混匀备用。,转基因成分PCR定性检测技术,转基因成分PCR定性检测技术,电泳及分析,1、琼脂糖凝胶电泳2、结果分析3、异常情况分析,转基因成分PCR定性检测技术,1、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。1）琼脂糖：根据琼脂糖溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等。,转基因成分PCR定性检测技术,2）凝胶浓度选择：,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,转基因成分PCR定性检测技术,3）电泳缓冲液,常用三种缓冲液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解,转基因成分PCR定性检测技术,4）上样缓冲液（Loadingbuffer）：一般由水、蔗糖和染料(例如：二甲苯胺、溴酚蓝、溴甲酚绿等)组成。DNA样品首先要与上样缓冲液混合，才能加入凝胶中电泳。DNA样品的最大上样量根据片段的数量而定。在0.5cm宽的条带中，能被凝胶成像仪检测到的溴化乙锭染色的DNA，最小量约为的2ng。如果含有超过500ng的DNA，导致拖尾。,上样缓冲液有以下3个作用：增加样品的密度保证DNA均匀加入到点样孔中；使样品着色，以简化点样过程；在样品中加入染料，能使其在电场中以可预见的速率移动。,转基因成分PCR定性检测技术,5）琼脂糖电泳的染色剂,最常用的染色剂：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。极强的诱变剂/致癌物质，有慢性毒性。在操作时必须戴手套。GoldView一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。较为安全。,转基因成分PCR定性检测技术,6）DNA分子量标准：,为了判断DNA片段的大小，需要同时加入DNA分子量标准进行电泳。DNA分子量标准应能覆盖所测DNA片段的预期大小。,转基因成分PCR定性检测技术,PCR产物电泳检测操作步骤：,1）制胶。将适量的琼脂糖加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成浓度为2.0%（w/v）的琼脂糖溶液，然后按每100ml琼脂糖溶液中加入5lEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上（防漏胶），插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板（如样品孔内有气泡，应除去！）。,2）点样。吸取10l的PCR产物加入点样孔中，在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准；在点试样的同时，应同时点阴性对照、阳性对照和空白对照。,3）电泳。接通电源，在5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）条件下电泳30-40min。切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）！,三种电泳检测的区别,真实性检测使用垂直测序电泳槽胶板大小35cm45cm厚度0.4mm,转基因检测使用水平核酸电泳槽胶板大小2016cm，1516cm厚度3-5mm,纯度检测使用垂直电泳槽胶板大小10.518.5cm厚度3-5mm,转基因成分PCR定性检测技术,2、结果分析,原则：,如果阳性对照的PCR反应中，玉米内标准ZSSB基因、CaMV35S启动子和/或NOS终止子和Bt基因得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出SPS基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。否则，表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。,转基因成分PCR定性检测技术,结果判断：,在PCR反应体系正常工作的前提下，检测结果通常有以下几种情况：1、在试样PCR反应中，内标准ZSSB基因和Bt基因均得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，无论CaMV35S启动子和/或NOS终止子是否得到扩增，表明样品检出Bt基因。,2、在试样PCR反应中，内标准ZSSB基因、CaMV35S启动子和/或NOS终止子得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，但Bt基因没有得到扩增，或扩增出的DNA片段与预期大小不一致，表明样品检出CaMV35S启动子和/或NOS终止子，未检出Bt基因。,3、在试样的PCR反应中，内标准ZSSB基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，Bt基因、CaMV35S启动子和NOS终止子没有得到扩增，表明样品未检出Bt基因。,转基因成分PCR定性检测技术,3、检测结果异常情况分析,拖尾（Smear现象）：,原因：模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,对策：纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数,转基因成分PCR定性检测技术,非特异性扩增：,原因：模板或引物浓度