核酸探针描述.ppt

1,第五章核酸探针技术检测食品微生物,2,核酸分子杂交（nucleicacidhybridization）指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子杂交分子。,3,第一节核酸探针杂交的基本理论一、变性与复性,4,DNA的变性(denaturation)：,在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。,5,6,解链温度（融解温度，Tm）(meltingtemperature)：,使50%的DNA发生变性时的环境温度。DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。,7,8,增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。,9,DNA的复性（renaturation)：,在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。,10,11,减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。,12,1.常用的变性方法：,热变性,酸碱变性,化学试剂变性,13,2.影响复性的因素,序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢离子强度有利于复性DNA浓度复性,Tm值的估算20bpTm=69.3+0.41(G+C)%Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺%）,14,核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。,15,16,17,二、影响杂交的因素,1.核酸分子的浓度和长度,2.温度：比Tm低2530较适宜,3.离子强度：离子强度杂交反应率,18,4.杂交液中的甲酰胺甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，含30%50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到3042。使用甲酰胺的优点：,低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。,19,注意：,待测核酸顺序与探针顺序同源性高的杂交，用水溶液时取68，用50%甲酰胺溶液时取40。,待测核酸顺序与探针同源性不高时，以50%甲酰胺溶液在3540杂交。,20,5.核酸分子的复杂性直接影响复性几率。,6.非特异性杂交反应：在杂交前将非特异性位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。,常用封闭物：变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA高分子化合物：Denhardt溶液脱脂奶粉,21,第二节核酸探针,一、探针的选择原则,1.高度的特异性,2.制备探针的难易性和检测手段的灵敏法,二、探针的种类,22,1.基因组DNA探针,从基因组DNA文库中选取某一基因片段,与载体连接（质粒、噬菌体）,克隆(PCR扩增),酶切,优点：无性繁殖、制备方法简单；不易降解（与RNA比较）；标记方法成熟。,23,2.cDNA探针（complementaryDNA）,S1核酸酶切平两端,优点：不含内含子及高度重复序列但不易获得,载体连接,克隆,通过逆转录,双链cDNA,加接头限制酶粘性末端,24,3.RNA探针：检测DNA和mRNA,优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少,未杂交探针可用RNase降解，减少本底的干扰。,缺点：易降解，标记方法复杂,25,4.寡核苷酸探针,优点：可根据需要合成相应序列；探针短,序列复杂性低,分子量小，因此杂交时间短;长度只有1050bp，该识别序列内1个碱基的变化可明显降低杂交Tm值。可大量合成，价格低，能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。,26,三、探针设计原则：,长度：1050bp,碱基成分:G+C含量为40%60%,探针分子内无互补序列。,避免同一碱基重复出现。,一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基同源。,27,四、探针标记物的选择,理想的标记物：,具有高度的灵敏性,与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性,检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉；,若用酶促方法标记，应对Km影响不大,28,（一）常用的放射性标记物,常用探记探针的同位素：32P、3H、35S、14C、125I、131I,29,2.特性：检测特异性强；,灵敏度高；,对酶促反应无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；,易造成放射性污染；,半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。,30,3.探针标记的方法,缺口平移法（nicktranslation）实质：用-32PdNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记。,31,32,随机引物法（randompriming）人工合成的68个核苷酸长的各种不同排列顺序的混合物，它们可以随机地互补到DNA探针的某一处，作为引物，在Klenow片段作用下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反应液中加入-32PdATP时，即可形成放射性同位素标记的DNA探针，但探针DNA序列是长短不等的。,优点：比活度高，结果稳定,33,34,用T4多核苷酸激酶标记DNA5末端,5-pCpGpApCpG-3,碱性磷酸酶(AKP）5-HOCpGpApCpG-3,-32PATPT4噬菌体多核苷酸激酶（PNK）,5-32PCpGpApCpG-3,35,Klenow片段快速标记DNA探针末端,用枯草杆菌蛋白酶切割可得两条多肽链,N,C,53外切酶,35外切酶,53聚合酶,小片段(36000)Klenow片段（67000）,3CTTAAG5,5GAATTC3,EcoR,5GAATTC3,3CTTAAG5,Klenow,dNTP,-32PdATP,5GAATTAATTC33CTTAATTAAG5,36,（二）常用的非放射性标记,优点：无环境污染，可较长时间贮存,方法：1.酶标记法2.化学标记法,要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响DNA三维空间构象的形成。常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、补骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylominofluorene）,37,1.生物素标记核酸探针Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。,2.地高辛（Dig）标记核酸探针,38,39,40,41,42,43,第三节核酸分子杂交技术,一、类型：根据反应环境分为,1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。,2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。,44,二、固体支持物种类,硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板等。选择原则：,具有较强的结合核酸的能力；与核酸的结合比较稳定尽量少的非特异性吸附,45,三、常用固相杂交类型,Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。,46,1.Southern印迹杂交,主要步骤：,47,纯化的待测DNA样品,琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段,凝胶上DNA变性,中和,DNA转印至NC膜,预杂交,限制性内切酶酶切后（EDTA，65灭活限制酶）,变性液（碱变性）,Tris缓冲液,高盐下,烘干、固定,杂交,放射自显影,结果分析,48,49,southern印迹,载体,凝胶,吸水纸,缓冲液,滤纸,固定到载体,50,2.Northern印迹杂交是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到NC膜上的方法。与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblotting。,3.斑点杂交（dotblot）(线状圆形),51,4.原位杂交（insituhybridization）直接用探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。应用：1）观察基因在组织中的表达2）确定基因在染色体中的定位,52,5.菌落原位杂交（colonysituhybridization）,将细菌从平板转移到NC膜上,裂解细菌释出DNA,烘干,杂交,53,四、核酸杂交的应用在医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因诊断。1、遗传病的诊断：例：-地中海性贫血的检验2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速鉴定3、癌基因点突变分析4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子鉴定,54,蛋白杂交,一、蛋白质的免疫印迹（western)场所：硝酸纤维素膜待检分子：蛋白探针：抗体杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用