抗血清制备及抗体效价测定

.4实验过程 3第一部分NDV抗血清的制备一、实验原则3二。实验仪器、材料和试剂31.仪器32.材料3试剂3三。方法和步骤3(1)NDV兔抗血清3的制备1.兔子捕捉方法32.兔子固定方法33.初级免疫接种34.二级免疫接种35.临终免疫36.血液测试37.颈动脉放血38.血清分离39.抗血清的保存3(2)NDV小鼠抗血清3的制备1.小鼠的捕获和固定32.初级免疫接种33.二级免疫接种34.临终免疫35.血液测试36.放血37.血清分离38.抗血清的保存3第二部分。抗体滴度3的琼脂双扩散试验一.基本原则3二。实验仪器、材料和试剂31.仪器32.材料3试剂3三。方法和步骤31.灭活新城疫病毒Ulster 2C株3的抗原提取准备2。1%琼脂糖33.翻转板34.冲压35.稀释抗血清36.样品添加37.孵化38.结果观察3第三部分。酶联免疫吸附法测定NDV抗血清效价3一.基本原则3二。实验仪器、材料和试剂31.仪器32.材料3试剂3三。方法和步骤31.新城疫病毒Ulster 2C株3灭活抗原的提取2.抗原涂层3关闭4.洗涤板35.稀释抗血清36.添加抗血清37.洗涤板38.添加酶标记的二抗39.洗涤板310.彩色渲染3终止312.阅读313.结果决策3第四部分。用蛋白质印迹实验3鉴定抗体特异性一.基本原则3二。实验仪器、材料和试剂31.仪器32.材料3试剂3(1)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂：3(2)蛋白质印迹相关试剂：3三。方法和步骤31.SDS-第3页2.转移膜33.免疫测定3(1)膜封闭3(2)膜清洗3(3)加入第一抗体3(4)膜清洗3(5)与第二抗体的相互作用：3(6)膜清洗3(7)奥德赛近红外成像仪扫描成像3实验结果与分析 3NDV抗血清的制备及抗体效价的测定摘要：新城疫病毒(NDV)抗血清又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。病毒分类学上的位置属于副粘病毒科和副粘病毒科之一。这种病毒主要对鸡、串珠鸡和火鸡有害，并在受感染的鸡中迅速传播。剧毒菌株会毁灭整个群体。用新城疫病毒灭活疫苗(Ulster 2C株)灭活疫苗以不同方式免疫家兔和小鼠，制备新城疫病毒抗血清。也叫免疫血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体滴度指的是抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，其免疫效果通过与抗原的反应程度来表达。本实验主要进行兔和小鼠新城疫病毒抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验和兔流行印迹试验进行抗体效价检测。关键词：NDV抗血清抗体效价免疫实验过程这个实验分为四个主要步骤：第一部分NDV抗血清的制备第二部分。琼脂双扩散试验检测抗体滴度第三部分。酶联免疫吸附法测定NDV抗血清效价第四部分。免疫印迹法鉴定抗体特异性第一部分NDV抗血清的制备首先，实验原理将免疫原性物质注射到健康动物体内后，抗原可以刺激相应的B细胞增殖和分化，形成浆细胞并分泌特异性抗体。当动物血清中有大量抗体时，收集动物血液并分离出血清以获得所需的抗血清(免疫血清或抗体)。因为抗原物质通常具有多个抗原决定簇，所以它们可以刺激身体产生各种抗体以形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，并免疫血清事实上，它是一种含有各种抗体的混合物，所以通过这种免疫方法获得的免疫血清也称为多克隆抗体(PcAb)。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程。为了获得强特异性，对于高滴度的抗血清，除抗原因子外，还次数、间隔时间和注射途径等。对于免疫原性弱的可溶性抗原(如蛋白质抗原)，应添加佐剂增强免疫力的药剂。本实验介绍了新城疫病毒(NDV)抗血清的制备。新城流行病新城疫病毒(NDV)也被称为亚洲鸡瘟病毒、假鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。生病了在分类学上属于副粘病毒科和副粘病毒科一个物种。这种病毒主要对鸡、串珠鸡和火鸡有害，并在受感染的鸡中迅速传播。该毒株能使整个鸡群完整。大规模毁灭。用新城疫病毒灭活疫苗(Ulster 2C株)以不同方式免疫家兔和小鼠制备新城疫病毒抗血清。二。实验仪器、材料和试剂1.工具5mL无菌冻存管、2.5毫升和1毫升注射器、塑料静脉插管、碘、75%酒精棉球、剪刀、止血钳、250毫升无菌三角瓶、50毫升无菌尖底离心管、兔固定槽、兔解剖台、棉线、5mL吸头和移液管、培养箱、离心机。2.材料兔子：1-2公斤清洁级雄性或非怀孕雌性；小鼠：6-8周龄的SPF昆明小鼠。试剂新城疫病毒Ulster 2C灭活疫苗(南京美利亚动物卫生公司)，0.01毫巴(pH7.2)(8克氯化钠，0.2克KCl，2.9克磷酸氢二钠，0.2克磷酸二氢钾，用氢氧化钠调节酸碱度至7.2，加入双蒸水至1000毫升)，麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。三。方法和步骤(1)NDV兔抗血清的制备1.兔子捕捉法捕捉和固定动物是动物实验的基本操作之一。正确捕捉和固定动物是为了避免伤害。动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，确保实验顺利进行。兔子很温顺，没有脚。锋利的爪子应该避免被它们抓伤，并且更容易抓住。不要抓住兔子的耳朵，拖着它的四肢，或者用手提起它的腰部和背部。积极的正确的方法是用右手抓住脖子后面的毛，轻轻抬起动物，然后用左手抓住它的臀部，使兔子主要减肥。在你左手的手掌中(如图1所示)。图1。兔子的捕捉方法2.兔子固定法根据不同的实验需要，兔子固定盒或兔子手术台通常用于兔子固定。兔子固定盒通常由木头、铁片或树脂材料制成，便于拆卸、清洗和消毒。它通常用来固定兔子、狐狸、浣熊等。使用时，可将兔子放入兔子固定盒中，单人无需任何帮助即可对兔子等动物的耳朵进行标记，注射药物，耳缘静脉注射，取血，观察耳朵血管变化等，通常用于限制动物整体生理、药理、免疫实验中实验对象的活动。(图2)图2。兔子固定盒的固定方法当观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时，兔子应该以仰卧位固定在兔子手术台上。去吧。固定方法如下：首先，用四条1cm宽的布带作为求生陷阱，分别套在兔子四肢的手腕或脚踝上上图，拉紧布带的长头，将兔子仰卧在兔子手术台上，用兔子头固定器固定头部，然后将两个前肢伸直，从背后穿过两个前肢的系带，将另一侧的布带压在这一侧的前肢上，分开四肢不要把它绑在兔子手术台的木柱上。(图3)图3。兔子手术台的固定方法3.初次免疫在兔的爪子、腋窝淋巴结、背部两侧、颌下、耳后和其他部位周围选择6-10个免疫点。点、皮下、皮内或肌肉注射，每点注射新城疫病毒Ulster 2C灭活疫苗0.1 0.2毫升.如果使用没有佐剂的灭活新城疫病毒Ulster 2C株，也可以通过耳静脉注射进行免疫。(图4)图4。兔耳缘静脉注射法4.二级免疫第一次免疫后两周，用与第一次免疫相同的方法选择6-10只新城疫病毒Ulster 2C灭活疫苗第二次免疫后，间隔2周，然后按照上述二次免疫方法进行第三次免疫。6.验血最终免疫7天后，从兔耳静脉采集2mL血液，分离血清，通过琼脂双向扩散试验测定抗体。当抗体滴度达到1:16或更高(稀释抗体)时，可以进行放血；如果效价不高，免疫可以增强l倍，然后线路检测。7.颈动脉放血免疫的兔子被固定在兔子手术台上，低下头露出脖子。皮下组织沿着气管被直截了当地分离，暴露出气管前面的胸锁乳突肌。胸锁乳突肌与气管之间的颈部三角区的疏松组织被分离，气管两侧肌束下可见淡红色搏动的颈动脉。(图5)图5。兔颈部血管神经的分布仔细分离双侧动脉，在每一侧动脉上分别套两根棉线，一根在远端，另一根在近端。(图6)。图6。兔颈部动脉血管首先将一侧动脉的远端丝线结扎紧，然后用止血钳夹住近端(止血钳头部用细塑料管包裹，以免损伤动脉)。用小而尖的眼用剪刀在动脉壁两侧的线中间切开一个小孔，以便插入一个塑料静脉插管(或一个大的钢制针头)，然后用棉线将静脉插管固定在心脏端附近，以防止其滑出动脉。轻轻松开止血钳，血液将很快沿导管流入三角瓶中。当血液慢慢流出时，用同样的方法将对侧动脉插管放血，并将动物固定架的后端抬高以增加放血量。一般来说，兔子可以出血80-100毫升。8.血清分离将血液在室温下凝固约1小时，然后在4下放置过夜以收缩血凝块；用5mL无菌移液管吸取上层血清，并转移到50毫升无菌尖底离心管中。然后从血管壁上分离出血凝块，将血清倒入另一个50毫升无菌的尖底离心管中，在4下以2500克离心10分钟，将上清液即血清部分与上述血清混合，将混合的血清在4下以1500克离心10分钟，弃去沉淀物以收集血清。9.抗血清的保存(1)4保存：抗血清灭菌后，加入0.0l%硫柳汞或0.1%叠氮化钠，保存液态普通冰箱可储存3个月至半年，当效能高时，一年内不会影响使用。(2)冷冻保存：抗血清灭菌后，加入等量甘油，在-20或-40保存5年抗体滴度不会显著降低。抗体不应反复冷冻和解冻。反复冻融可显著降低抗体滴度。(2)NDV小鼠抗血清的制备1.小鼠的捕捉和固定老鼠比老鼠温和。虽然一个人应该小心咬自己的手指，但不需要戴手套去抓它们。你可以先用右手抓住它。提起鼠标尾部，将其放入鼠笼或实验台上，用左手拇指和食指抓住鼠标两耳后颈部背面的皮肤，放置鼠标体把它放在你左手的心脏，伸直你的后腿，用你的无名指和小指按住老鼠的尾巴。有经验的人可以直接用左手的小指钩。从老鼠的尾巴开始，用拇指、食指和中指快速捏住耳朵后部的皮肤。如果操作时间长，也可以固定。在鼠标固定板上。(图7)图7。小鼠的捕获和固定2.初次免疫将新城疫病毒Ulster 2C灭活疫苗分别肌肉注射、皮下注射或皮内注射到昆明小鼠背部0.2毫升，或腹腔注射新城疫病毒Ulster 2C灭活疫苗0.2毫升(1)腹腔注射法：小鼠固定后，腹部向上，颈部伸直，右手握注射器(针头5 6)。从腹部上方以30度角刺穿腹腔(3)肌肉注射法：两人合作时，一人用上述方法抓老鼠，另一人用左手伸直一条后腿，用右手握住注射器，注射部位应选在后腿上部外侧(针数同上)。如果由一个人操作，捕鼠方法类似于腹膜内注射，除了将液体药物注射到肌肉中，每条腿的注射量不应超过0.1毫升(4)尾静脉注射法：将小鼠置于待放置的固定圆筒内，暴露小鼠尾部，用酒精或二甲苯棉球擦拭，或在40 50温水中浸泡片刻，使尾部血管扩张。左手拉动尾巴，选择扩张最明显的血管。用右手握住注射器(针头4 5)，将针头刺入血管，慢慢给药。如果推注时出现阻力和局部变白，针头不在血管中，应重新插入。穿刺应从靠近尖端1/3处的静脉开始，以便反复向上移动注射液。一般剂量为0.1 0.2毫升/10克，不超过0.5毫升/10克。图10。大鼠尾部皮下注射3.二级免疫首次免疫后每隔2周，将新城疫病毒肌肉注射、皮下注射或皮内注射入昆明小鼠背部腹腔注射0.2毫升Ulster 2C灭活疫苗或0.2毫升新城疫病毒Ulster 2C灭活疫苗。4.临终免疫在第二次免疫后每隔2周将新城疫病毒肌肉注射、皮下注射或皮内注射入昆明小鼠背部腹腔注射0.2毫升Ulster 2C灭活疫苗或0.2毫升新城疫病毒Ulster 2C灭活疫苗。5.验血最后一次注射后7天，从小鼠眼球收集0.2毫升血液，分离血清，通过琼脂双向扩散试验测定抗