第二章 遗传标记1.ppt

第二章遗传标记,本章主要内容,形态标记细胞学标记生化标记分子标记,遗传标记的类型,遗传标记（geneticmarker）:指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。,遗传标记的类型,形态学标记（morphologicalmarker）细胞学标记(cytologicalmarker)生化标记(biochemicalmarker)分子标记(molecularmarker)：或DNA标记。,即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点：形态标记简单直观、经济方便；缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的;(2)且多态性较差，表现易受环境影响，(3)有一些标记与不良性状连锁。(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。,一、形态标记,（一）、形态标记的应用,张庆勤等在对燕麦与节节麦、黑小麦的杂交的研究中，根据杂种后代小穗着生的部位，芒的生长位置，从形态上验证了在杂种F1植株中存在有燕麦的特征性状。田崎通过对来自不同地方的120个小豆品种进行的调查发现，根据分枝性、主茎的坚实度及柔软度、主茎基部粗度、最长分枝的长度等4项指标，可以把小豆株型按照其指数分成A、B、C、D这4个基本类型。任刚通过对黄瓜属种间杂交新种的形态学研究表明，杂交新种自交一代各个单株除了在节间长和侧枝数上有差异之外，其他方面均没有差异。,（二）应用实例,1）具有代表性的三种锦鸡儿的形态学观察,小叶、中间、树锦鸡儿植物的照片,2）不同棉花材料的形态学观察,亚洲棉（A2）2.比克氏棉（G1）3.亚洲棉比克氏棉双二倍体（A2A2G1G1）4.陆地棉（AADD1）5.海岛棉（AADD2）6.（A2G1）AD1杂种F17.（A2G1）AD2杂种F1,（亚比棉陆地棉）杂种F1与其亲本的形态特征比较,（亚比棉海岛棉）杂种F1与其亲本的形态特征比较,即植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。,二细胞学标记,（一）核型和核型分析定义,1核型-一般是指体细胞染色体在光学显微镜下所有可以测定的表型特征的总称。主要包括染色体的数目与形态结构特征两大方面的内容。染色体的数目包括染色体的基数、多倍体、非整倍体、B-染色体(B染色体)超数染色体,是存在于许多有机体中的额外染色体及染色体断片)。染色体的形态主要包括染色体的绝对大小和相对大小、着丝点和次缢痕以及随体的数目和位置等特征。,2.核型分析：核型分析就是指对核型的各种特征进行定量和定性的表述。核型分析是分析染色体数目和结构变异的基本手段之一。它在杂种细胞的染色体研究和基因定位，单个染色体的识别等方面具有重要意义。,什么是染色体分带技术,特殊的染料、染色方法，使同一染色体的不同区段呈现不同的染色效果带型，各种分带技术C、G、Q、R、N的出现，为染色体的精确鉴别提供了一条崭新的途径。,人类染色体核型分析（Q带）,女,男,Eg蚕豆的核型分析,2n=12，染色体长度：大小臂比：大小带型：同源编号,(二）核型分析的应用,1.核型分析应用于植物的分类研究2.核型分析应用于探讨物种的起源3.核型分析应用于外源染色体的检测与验证杂种的真实性,(三)核型分析内容,核型分析主要包括两个方面的内容:一个是染色体的数目，另一个是染色体的形态。,（四）核型分析的方法,1.取材观察染色体的适宜的材料的选取：凡是能进行细胞分裂的植物组织和单个细胞都可以作为观察染色体的材料，比如像一些植物的顶端分生组织（根尖和茎尖）、居间分生组织、愈伤组织和胚乳、大小孢子母细胞的减数分裂时期等等。但是并不是随时取来的材料都可以用。各类材料有自己的特点及取材操作的注意事项。可以采用种子萌发取根，鳞茎水培取根，扦插取根和植株上直接取根等等。一般常用根尖作为材料。对于那些难萌发的种子或有植株无种子的材料可以用茎尖进行染色体压片.,2.预处理,进行预处理的目的主要是（1）防止纺锤体的形成，因为没有了纺锤体的牵引，就会使的细胞分裂被迫处于中期阶段，从而能够获得很多的中期分裂相。（2）材料经过预处理后，就会引起染色体的收缩，使得染色体能够缩短，这样有利于通过压片，使得染色体很好的分散开。,1）固定目的：主要是利用化学药物能迅速杀死细胞，从而使得蛋白质变性和沉淀，并能尽量保持各种结构的原有状态。2）固定液：主要使用的固定液是卡诺固定液（1：3的冰乙酸和无水乙醇）,3.固定,3）固定所需要的时间：224小时，小材料，固定的时间应短一些，而对于大一些的材料，则固定的时间可以长一些。4）固定所需要的温度；一般固定是在低温冰箱里，但这并不是必需的条件。5）保存；经过固定后的材料可以保存在70%的酒精中待用。,4.解离,1）解离的目的：为了方便压片，对于根尖和茎尖等体细胞组织，需经过某些处理，以除去细胞之间的果胶层并能使细胞壁软化。2）解离方法；（1）酸解离：固定后的材料经50%酒精洗涤后，再转入蒸馏水中清洗干净后，转入1N盐酸于60恒温处理5-20min。当然，不同的作物需要解离的时间也会有所不同。（2）酶解离：一般用果胶酶、纤维素酶来进行。像做棉花的染色体，在用盐酸解离之前先用2%的纤维素酶与果胶酶进行解离，效果比较好,5.染色,1）常见的染色液(1)卡宝品红(2)洋红(3)地衣红(4)树脂蓝(5)甲苯胺蓝,6.压片操作,取出根尖，将根尖放在载玻片上，用镊子或刀片切除根冠和伸长区部分，留23毫米的分生区，加约1/3的染色液，再用镊子将材料分割成若干小块加盖片，在盖片的一角压一硬纸，并用左手食指压紧以免盖片错动，右手拿解剖针用针尖轻轻敲击盖片使材料均匀散开。,7.镜检,在显微镜下观察染色体，可以从低倍到高倍，选染色清晰而又分散很好的中期分裂相，然后可以制作永久封片。,8.永久封片,做出的染色体片子，可以把其放在培养皿里临时保存。具体的做法是在培养皿里放一张滤纸，把滤纸浸湿，然后把做好的染色体制片放进去，这样可以临时保存好所做出的染色体片子，但是这种方法只能是作为临时保存用，因为随着时间的延长，染色体也会由于逐渐的缩水而收缩，最后就不能很清晰的看见染色体。,为了把好的染色体制片长久的保存下来，可以制作永久封片。作永久封片可以用冰冻脱片封片法，具体的做法如下：先把制好的染色体制片用冰冻制冷器进行冷冻，待冷冻后，用刀片把盖波片掀开，这个过程应该在没有解冻之前完成。然后分别把盖波片和载玻片放在37的烘箱中，将其烘干，等到烘干后，再在二甲苯中浸泡10-20min，最后用中性树胶进行封片。在这应该注意的一点是进行封片的时候应该把载玻片和盖波片分别进行封。当然，还有其他的方法也能进行制作永久制片。,永久封片的制作,亚比棉的染色体形态图、核型图及核型模式图,图2-4三种杂种（亚洲棉比克氏棉）陆地棉杂种F1的染色体形态图、核型图及核型模式图,图2-4三种杂种（亚洲棉比克氏棉）海岛棉杂种F1的染色体形态图、核型图及核型模式图,生化标记就是利用电泳技术对蛋白质、酶等生物大分子进行鉴定。主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是：指结构不同、功能相似的酶，也即具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个以上基因座位编码的酶的不同形式；等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。,三生化标记,1,3,5,7,9分别为晋A不育系的叶片、苞叶、花蕾(造孢细胞增殖时期、小孢子母细胞减数分裂时期、小孢子形成时期),2,4,6,8,10分别为保持系的叶片、苞叶、花蕾(造孢细胞增殖时期、小孢子母细胞减数分裂时期、小孢子形成时期)。图1棉花晋A及其保持系酯酶酶谱及模式图。,三生化标记实例,1,3,5,7,9分别为晋A不育系的叶片、苞叶、花蕾(造孢细胞增殖时期、小孢子母细胞减数分裂时期、小孢子形成时期),2,4,6,8,10分别为保持系的叶片、苞叶、花蕾(造孢细胞增殖时期、小孢子母细胞减数分裂时期、小孢子形成时期)。图2棉花晋A及其保持系过氧化物酶谱及模式图。,生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。,(一)生化标记的应用,1.生化标记在品种纯度和真实性鉴定上的应用2.生化标记在品种的亲缘关系和分类研究上的应用3.生化标记在杂种优势的预测上的应用4.生化标记在抗性鉴定上的应用5.生化标记在品种鉴定上的应用,四分子标记,（一）分子标记的定义：,分子标记：在生物系统和进化研究中，每个能反应遗传变异的，能提供系统学信息的多态位点称为一个分子标记，在遗传育种研究中每个与感兴趣的性状或目的基因连锁的多态性位点也称为一个分子标记。,(二)目前的分子标记类型,第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括RFLP、DNA指纹技术（DNAFingerprinting）等；第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、序列特征化扩增区域SCAR等；第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等。,（三）分子标记的特点,1.直接以DNA的形式表现，表现稳定2.数量多3.多态性高4.表现为中性，不影响目标性状的表达；5.许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。6.成本不太高,(四)分子标记技术的定义,1.分子标记技术：能提供分子标记的分子生物学技术称为分子标记技术。,2.分子标记技术的优点,1)分子标记技术选用的分子信息比较稳定采用常规的形态标记或细胞学标记进行分类时，一些表型特征是不稳定的，很容易受环境因素的影响。有些物种在自然选择的作用下，为适应当地的生态环境，某些表型特征会发生变化，形成适应当地环境的特殊生态类群，相应的，野生物种或栽培品种会获得相异的分子信息，但其持有的分子信息是可以稳定遗传的，不会因环境或栽培条件的改变而发生变化。,分子标记技术可提供植物有关的任何基因（或DNA片段）或它们编码的蛋白质的直接或间接的结构证据，并可以应用到任何大小、任何地区的生物。植物基因组所包含的信息量是巨大的，就好像百科全书一样，是个巨大的信息库，它不仅与植物的生长发育密切相关，而且在它的核酸序列中记录了物种的起源和进化。在许多物种内，仅种内的遗传变异就很惊人，种间的遗传变异就更为庞大。,2)分子标记技术所提供的遗传信息量是无限的,相似性(similarity)和同源性(homology)是两个完全不同的概念。相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。当相似程度高于50%时，比较容易推测检测序列和目标序列可能是同源序列；而当相似性程度低于20%时，就难以确定或者根本无法确定其是否具有同源性。总之，不能把相似性和同源性混为一谈。所谓“具有50%同源性”，或“这些序列高度同源”等说法，都是不确切的，应该避免使用。,3)分子标记技术能很好的区分同源性和相似性,传统主要根据形态性状的经典遗传学的分类方法有明显的局限性，在自然选择和人工选择的作用下，有时毫不相干的物种由于长期生活在共同的环境中会形成相似的形态性状，有时没有亲缘关系的物种由于长期生活在共同的环境中，为适应环境的需要，会生成一些相似的形态性状，这种相似性给分类造成混乱。传统的遗传学分类方法无能为力，但分子标记技术能达到很好的分离目的。在分子生物学技术中可以用DNA杂交的方法来区分同源性和相似性。例如；两个DNA样品用RAPD-PCR得到的相同分子量的多态性片段可能是同源的但也不一定是同源的，将该片段切下来作为探针与原来的RAPD带谱进行杂交，有杂交信号的则是同源的性状，无杂交信号的则是相似性状。,4)分子标记能提供物种间比较共同的尺度,分子标记技术中以物种的DNA作为研究的最初样本，它具有任何生物有机体包括动物、植物和微生物所具有的分子属性，因此，分子标记技术所获得的分子数据，可以作为共同尺度来直接比较任何有机体任何分类层次之间相对水平的遗传变异。,5)分子标记技术打开了遗传学研究的大门,在还没有分子技术之前，经典遗传学的研究范围是比较有限的，很多的研究主要局限