T4 DNA 连接酶

T4脱氧核糖核酸连接酶，即T4脱氧核糖核酸连接酶，能够催化粘性或平端双链脱氧核糖核酸或核糖核酸的5-P末端和3-OH末端之间磷酸二酯键的结合。三磷酸腺苷是催化反应的辅助因子。同时，T4DNA连接酶可以修复双链、双链或核酸/核酸杂交体上的单链缺口。目的：DNA排列酶常用于连接DNA片段与载体、接头或衔接子等。它也可用于缺口修复和连接酶介导的核糖核酸检测。来源：这种T4 DNA连接酶由大肠杆菌表达。表达基因的来源是T4成瘾细菌。活性的定义：一个单位被定义为在16下30分钟内，在20 l的assa中给出50%的DNA Hindi片段指令所需的量。含50毫摩尔三硫氰酸盐、7.5毫摩尔氯化镁、10毫摩尔二硫氰酸盐、1毫摩尔三磷酸腺苷、25微克/毫升牛血清白蛋白和0.12微米(300微克/毫升)5-脱氧核糖核酸末端浓度的混合物。200U等于1个维斯单位，就维斯单位而言，这个产品总共有1000个单位。纯度：不含核酸内切酶、核酸外切酶和磷酸酶，不含核糖核酸酶，符合常规连接反应的要求。酶储存溶液：20毫摩尔Tris，pH 7.5，50毫摩尔KCl，1毫摩尔DTT，0.1毫摩尔乙二胺四乙酸和50%(体积比)甘油。10X连接缓冲液：400 mM Tris，pH 7.8，100 mM氯化镁，100 mM差热，5 mM三磷酸腺苷.失活或抑制：在65孵育10分钟可导致T4 DNA连接酶失活；当氯化钠或KCl浓度超过200毫摩尔时，T4脱氧核糖核酸连接酶被强烈抑制。装箱单：产品编号产品名称包装D7008-1T4脱氧核糖核酸连接酶(1000单位/微升)200，000美元D7008-210X连接缓冲液1.5毫升-说明1份保存条件：储存在-20。注意：对于转化大肠杆菌的常规操作，不需要纯化连接产物，连接产物可以直接用于转化。然而，当通过电转化转化大肠杆菌时，通常在电转化之前通过DNA纯化试剂盒或酚氯仿提取法纯化DNA是合适的。当需要平端连接或快速连接时，建议使用碧云的快速DNA连接套件(D7002/D7003)。T4DNA连接酶可以在平端连接，但其效率低。普通的连接反应不需要凝胶电泳观察。如果需要对连接产物进行凝胶电泳观察，建议通过在65孵育来灭活T4 DNA连接酶。10分钟以避免由T4 DNA连接酶和DNA结合引起的条带移位。为了您的安全和健康，请穿戴实验服和一次性手套。使用说明使用说明：1.聚合酶链反应产物或酶片段与常见载体的连接：A.取1-2g载体，酶切过夜，或至少酶切3-5小时以上。确保酶被尽可能充分地切割，否则将来会导致大量生产。自交克隆。在载体的酶切完成后，可以用试剂盒纯化载体，如碧云天的聚合酶链反应纯化试剂盒/脱氧核糖核酸纯化试剂盒(D0033).载体也可以通过常规的酚氯仿萃取乙醇沉淀法纯化。酶消化产生更大的片段(大于50-60bp)建议切割并回收。C.对于聚合酶链反应产物：在聚合酶链反应产物的凝胶电泳后，切割凝胶以回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使手术是用试剂盒进行的，如毕云天的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以通过反复冻融等方法回收DNA片段。D、将回收的聚合酶链反应产物或其它质粒或待切割的DNA片段用合适的内切酶切割，然后纯化切割产物。注意：该步骤中的酶消化不需要特别充分。一般情况下，酶消化效率可达80-90%以上。也就是说，酶消化这一步通常，酶被切割1-2小时。酶切产物可以使用试剂盒纯化，例如用于比云日/脱氧核糖核酸纯度的聚合酶链反应纯化试剂盒化学试剂盒(D0033)。载体也可以通过常规的酚氯仿萃取乙醇沉淀法纯化。(e)取约25-100ng酶切纯化后的载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应物。部门。注1:在许多情况下，回收后很难定量，因为载体的量和插入片段的量相对较小。这时，根据之前的回收电泳带的亮度是粗略估计的。通常，一定的测量目标波段亮度和参考波段亮度之间的比例关系。然后根据预期的纯化或凝胶回收产率计算最终获得的载体数量与待插入片段数量之间的比例关系。注2:一般来说，每次反应使用0.2-0.5l连接酶就足够了。如果希望进一步提高连接效率，可以进行连接酶的用量增加到1 l带菌者大约50-100公斤要插入的片段大约是载体摩尔数的3倍10X连接缓冲液2l双蒸水或MilliQ水至20lT4 DNA连接酶0.2-0.5l总体积约20lF.用移液管轻轻吹并混合，或稍微混合涡流，在室温下离心几秒钟，让液体在试管底部积累。G 20-25孵育连接1-2小时，或16孵育连接过夜。注1:对于双平端连接，必须通宵连接。对于双平端连接，直接使用T4 DNA连接酶是低效的。建议使用碧云的快速脱氧核糖核酸连接试剂盒(D7002/D7003)。注2:以下方法可用于快速获得所需的克隆：对于20l粘性末端连接反应，连接1-2小时后，有可能取10l直接转化大肠杆菌，其余10l可在16孵育过夜。如果第二天成功获得克隆，则可以输入。进入下一个实验；如果第二天转化的大肠杆菌没有获得预期的克隆，则可以进行过夜连接的剩余连接生产。该物质再次转化为大肠杆菌。H.然后直接取连接产物转化感受态细菌。2.聚合酶链反应产物和测试载体的连接：A.对聚合酶链反应产物进行凝胶电泳后，切割凝胶以回收预期大小的DNA片段。凝胶中的DNA片段的回收可以通过使用试剂盒来进行。例如，碧云天的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。DNA片段也可以通过反复冷冻和解冻来回收。(b)根据T载体的指示取适量的T载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应系统。注1:在许多情况下，回收后难以定量，因为载体和聚合酶链反应产物的量相对较少。根据恢复前的电泳粗略估计了条带的亮度。通常，一个特定的DNA分子量标准带被用作参考，通过灰度来估计或半量化你。目标波段和参考波段的亮度比。然后根据预期的纯化或凝胶回收产率进行计算最终获得的载体量与聚合酶链反应产物量的比率。注2:一般来说，每次反应使用0.2-0.5l连接酶就足够了。如果希望进一步提高连接效率，可以进行连接酶的用量增加到1 lt载体适量要插入的片段大约是载体摩尔数的3倍快速连接缓冲器(2X)2l双蒸水或MilliQ水至20l快速T4脱氧核糖核酸连接酶0.2-0.5l总体积约20lC.用移液管轻轻吹并混合，或稍微混合涡流，在室温下离心几秒钟，让液体在试管底部积累。D.在20-25孵育1-2小时或在16过夜。注意：以下方法可用于快速获得所需的克隆：对于20l粘性末端连接反应，在连接1-2小时后，有可能取10l直接转化大肠杆菌，其余10l可在16孵育过夜。如果第二天成功获得克隆，则可以输入。进入下一个实验；如果第二天转化的大肠杆菌没有获得预期的克隆，则可以进行过夜连接的剩余连接生产。该物质再次转化为大肠杆菌。e .直接取转化感受态细菌的连接产物。3.接头或RNAi片段和载体连接：A.载体的酶消化和纯化与步骤1a和1b相同。B.接头或RNAi片段的退火可以选择合适的DNA退火缓冲液，例如，蓝天退火缓冲液DNA寡聚物(5X)(D0251)退火。(c)长度大于8bp的接头或退火的RNAi片段可以按照5:1比1033601的比例与载体连接。例如如果载体是0.03摩尔，插入片段可以是0.15到0.3摩尔。长度小于8bp的接头需要调整到10:1上面。D.以下步骤11.