SDS-PAGE 各成分作用

SDS-PAGE电泳的原理和浓缩凝胶浓缩样品的原理(甘氨酸的作用)SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。 简要介绍了SDS-PAGE的基本原理。SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在聚丙烯酰胺凝胶系统中引入SDS，SDS破坏分子内与分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂破坏半胱氨酸间的二硫键，蛋白质在含有一定浓度强还原剂的SDS溶液中与SDS分子成比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合体该复合体通过结合大量的SDS，形成在蛋白质失去本来电荷的状态下仅保持本来分子大小的负离子团块，减少或消除各种蛋白质分子间的自然电荷差异，SDS与蛋白质的结合分子量在15KD到200KD之间，蛋白质迁移率与分子量的对数具有线性关系，如果将logMW=K-bX，式中： MW为分子量，x为迁移率，k，b为常数，已知分子量的标准蛋白质的迁移率绘制成分子量对数，则未知蛋白质在相同条件下电泳，其电泳迁移率为15KD到200KDSDS-PAGE电泳成功的关键是什么？溶液中SDS单体的浓度SDS以单体和SDS-多肽胶束的混合形态存在于水溶液中，能够与蛋白质分子结合的是单体。 为了保证蛋白质和SDS的充分结合，它们的重量比必须是1:4或1:3。 样品缓冲液的离子强度，SDS与蛋白质的结合量仅依赖于平衡时SDS单体的浓度，不仅仅在总浓度，而且在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。 因此，SDS电泳样品缓冲液离子强度低，常为10-100 mM。 二硫键是否被完全还原，在二硫键被完全还原后，蛋白质分子被分解，SDS定量结合亚基给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。 样品缓冲剂中-巯基乙醇的浓度始终为4-5%，二硫苏糖醇的浓度始终为2-3%。 前者具有挥发性，最好在使用前加入。SDS-PAGE缓冲液系统的选择、Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐等？一般可以使用分析蛋白质在稳定pH范围内与SDS不相互作用的缓冲液，但缓冲液的选择对蛋白质带的分离和电泳速度非常重要。 Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。 为了测定糖蛋白质的分子量，优选采用Tris-硼酸盐缓冲系统，但分子量小于15 kDa的蛋白质样品可以采用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。层压橡胶(或浓缩橡胶)的作用原理是什么？缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸在pH6.7下解离少，其有效游泳速度低，但氯离子具有高游泳速度，蛋白质游泳速度介于两者之间。 施加电压后，作为先导离子的氯离子和作为后续离子的甘氨酸离子分离，之后残留有电导率低的区域。 由于导电性与电场强度成反比，在该地区可获得高电压梯度，加速甘氨酸离子的游泳，追赶氯离子，确立甘氨酸与氯离子的电压梯度与游泳速度之积相等的稳定状态，使这些带电粒子以相同的速度游泳，两离子之间有明显的边界甘氨酸与氯离子的界面通过样品进入浓缩凝胶，在界面移动前有较低的电压梯度，界面后有较高的电压梯度。 由于蛋白质分子在迁移界面前的迁移速度低于氯离子，氯离子可以迅速越过。 在界面移动的蛋白质处于高电压梯度，其迁移速度比甘氨酸快。 因此，移动的界面堆积蛋白质分子，形成狭窄的带。 蛋白质在移动界面的浓度作用仅依赖于样品和浓缩凝胶中Tris-HCl的浓度(为什么？ 中所述情节，对概念设计中的量体体积进行分析。 浓缩凝胶为大孔凝胶，因此蛋白样品无分子筛作用。 移动界面到达浓缩凝胶和分离凝胶的界面时，凝胶的pH显着增加，甘氨酸大量解离。 此时甘氨酸的有效迁移速度明显增加，超过蛋白分子，直接转移到氯离子后。 凝胶孔径减小，蛋白质分子迁移速度降低，后落蛋白质在均匀的电压梯度和pH环境下迁移，通过固有电荷与分子大小分离。可知甘氨酸不作为缓冲成分参与，而作为后续离子参与电泳。以上内容主要摘自蛋白质电泳实验技术第二版(郭尧君编着)。 需要了解更详细内容的学生可以查阅这本书。SDS-page电泳问题问： Q:SDS-PAGE电泳的基本原理是？答： SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳在聚丙烯酰胺凝胶体系中引入SDS (十二烷基硫酸钠)，SDS破坏分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂破坏半胱氨酸间的二硫键，蛋白质浓度一定与SDS分子成比例地结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合体，该复合体通过结合大量的SDS，形成在蛋白质失去本来的电荷的状态下仅保持本来的分子大小的负离子团块，减少或消除各种蛋白质分子之间的自然电荷差异，SDS和蛋白质的结合分子量在15KD到200KD之间，蛋白质迁移率与分子量的对数具有线性关系，如果将logMW=K-bX，式中： MW为分子量，x为迁移率，k，b为常数，已知分子量的标准蛋白质的迁移率绘制成分子量对数，则未知蛋白质在相同条件下电泳，其电泳迁移率为15KD到200KD问：配合缓冲液系统对电泳的影响如何？在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液采用Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶为pH6.7，分离胶pH8.9； 电泳缓冲液使用Tris-甘氨酸缓冲系统。 浓缩凝胶由于pH环境为弱酸性，甘氨酸的解离少，电场导致电泳效率低的CL离子高，两者之间形成电导率低的区域，蛋白质分子在两者之间游动。 由于导电性与电场强度成反比，因此该带形成高电压整形度，按压蛋白质分子而聚集，浓缩成窄带。 样品进入分离凝胶后，凝胶中的pH增加，变成碱性，甘氨酸大量解离，迁移速度增加，氯离子后，分离凝胶的孔径缩小，在电场作用下蛋白质分子根据其固有的带电性和分子的大小分离。因此，pH对整个反应体系的影响非常重要，在实验中排除其他因素后仍无法顺利解决问题的情况下，必须首先考虑这个因素。问：样品怎么处理？答：根据样品的分离目的，主要有还原SDS处理、非还原SDS处理、具有烷基化作用的还原SDS处理三种处理方法。1、还原SDS处理：在还原剂中加入SDS和DTT (或Beta巯基乙醇)后，蛋白质的构象解离，电荷被中和，形成SDS和蛋白质结合的分子，在电泳中只用分子量进行分离。 一般的电泳是这样处理的，样品稀释成适当的浓度，加入上型Buffer，离心，用沸水煮5min，离心后加入样品。2、具有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以牢固保护SH基，得到狭窄的光谱带，而碘乙酸胺还可以捕捉过剩的DTT，防止银染时的纹理现象。 将100ul样品缓冲液中碘乙酸胺的10ul 20%在室温下保温30min。3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品通常只在1%SDS沸水中煮3min，未添加还原剂，蛋白折叠不受破坏，不能作为测定分子量使用。问： Q:SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用是？A:聚丙烯酰胺的作用：为丙烯酰胺和蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳的成败，与凝聚促进剂和环境密切相关制糊缓冲液：浓缩糊为pH6.7，分离糊为pH8.9，tris-HCL系统，具体作用后述TEMED和AP :促进凝聚，加速聚丙烯酰胺的凝固十二烷基硫酸钠(SDS ) :阳离子去污剂具有去除蛋白质电荷，解离蛋白质之间的氢键，去除蛋白质分子内的疏水作用，折叠肽的作用。如何提高SDS-PAGE电泳的分辨率？A:1、聚丙烯酰胺的充分聚合可以提高凝胶的分辨率。 方法：凝胶在室温凝固后，可在室温放置一段时间使用。 禁忌立即或在冰箱中放置4度，前者容易导致凝固不足，后者可能引起SDS结晶。 一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的染料有氨基黑、考斯布莱顿、银染色3种，染色方法因染料而异。 具体可参照郭尧君编着的蛋白质电泳技术手册 P82-103。q :“笑脸”(两侧向中央凹陷)带子的原因是？答：主要是由于凝胶中间部分凝固不均，多表现在厚凝胶中。处理方法：充分凝固后进行以下实验。问：“皱着眉头”(两侧向下半部分鼓起)乐队的原因是什么？答：主要出现在蛋白质垂直电泳池中，一般不排除两板之间的底部间隙气泡。处理方法：在两板之间加入适量缓冲液，可排除气泡。问：为什么会发生拖尾现象？答：主要原因是样品熔化效果差或分离胶浓度过高。处理方法：选择加样前离心的适当样品缓冲液，加适量样品促进剂电泳缓冲液时间过长，降低重制凝胶浓度。问：为什么会出现纹理现象？a :主要取决于样品不溶性粒子。处理方法：加入样品前离心适量样品促进溶剂。问：什么是鬼带？ 我该怎么办？答：“鬼带”是指大分子结构复杂的蛋白质分子在游泳道前端出现的(浓缩胶中)大分子的未知带或样品孔的底部有沉淀，主要是由于还原剂在加热过程中被氧化而失去活性，分离的蛋白质分子再次被折叠结合，亚基聚集成大分子但是，它对目标条纹具有相同的免疫学活性，在WB反应中发现了能够对应目标条纹的抗体作用。处理方法：加热煮沸后加入适量的DTT或Beta巯基乙醇，可以补充不足的还原剂，或者加入适量的EDTA阻止还原剂氧化。问：为什么溴酚蓝不作指示？答：我们在实验中经常遇到溴酚蓝从板底飞出，但蛋白质还没有掉落的现象。 主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理方法：降低更换正确pH的Buffer的分离橡胶的浓度。问：为什么电泳带那么粗？答：电泳中带粗是常见的，主要是不浓缩的原因。处理方法：适当增加浓缩橡胶的长度，保证浓缩胶液的pH值正确(6.7)适当降低电压问：为什么电泳电压高却电流低？a :这种现象一般容易发生在初学者身上。 例如电压为50v以上，电流为5mA以下。 主