分子生物学研究法(上)——DNARNA及蛋.ppt

基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。,5.1基因操作的基本工具,（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。,重组DNA实验中常见的主要工具酶,（二）基因克隆的载体载体三要素：自我复制能力携带外源基因片段大小插入位点多少大肠杆菌质粒载体：1、pSC101质粒载体长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产量很低。,2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到10003000个，占细胞总DNA的50%左右。ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，起始DNA合成。RNAI在RNAII的5末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工RNAII，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。没有Rop蛋白，RNAI基因就不能起始转录。,3、pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作仍较便利。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积10003000个拷贝，便于制备重组体DNA。,4、pUC质粒载体（包括四个部分）：来自pBR322质粒的复制起点（ori）氨苄青霉素抗性基因（ampr）大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）启动子及编码-肽链的DNA序列。特称为lacZ基因位于lacZ基因5-端的一段多克隆位点（MCS），外源基因插入破坏lacZ基因功能优点：更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500700个拷贝。,LacZ编码-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的-肽，IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的-半乳糖苷酶-肽与宿主细胞编码的缺陷型-半乳糖苷酶互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，水解培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落为白色。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。,5、pGEM-3Z质粒长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。含有两个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。6、穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。这类质粒载体可保证外源DNA序列在不同物种(原核和真核)的细胞间得到扩增，用途广泛。,7、pBluescript噬菌粒载体pBluescript是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。,(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；(iii)编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；(iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。,DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖。,5.2DNA基本操作技术,1、核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,2、细菌转化与目标DNA分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。图：细菌转化及蓝白斑筛选,为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competentcells）。CaCl2法将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转化效率可达到51062107个转化子/g超螺旋质粒DNA。电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至4后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（21010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm，时间跨度一般为4.55.5毫秒。电击转化与温度有关，一般在04进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,3、聚合酶链式反应（PCR）技术聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomicPCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。,PCR的故事,凯利穆利斯（KaryMullis），1944年出生，1962年在佐治亚理工学院化学工程专业毕业。受同学们的蛊惑，1966年报考加州伯克利大学生化专业研究生被录取。1968年一个人在Nature发表“时间反演的宇宙学意义”论文并侥幸通过了博士生资格考试。1972年，以“微生物铁转运因子的结构与有机合成”获得博士学位。毕业后，尝试写小说，但因“不能使一部分人物具有不幸的遭遇”而失败，又因厌恶天天宰杀实验小鼠而两次丢掉工作。他有一条可能引起不少同学共鸣的学习曲线：刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣知识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶段辞职。以后去一家小咖啡馆当了两年经理。1979年加入西特斯公司，负责DNA合成。正是费时费力的DNA合成（单引物，以算术级数增长），激发了他的思维。,1983年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关PCR原理的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，“绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡说八道。”普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出问题的要害所在，但肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没人想到呢？SCIENCE在1985年发表了第一篇关于PCR的论文。1993年，穆利斯由于发明了PCR获得诺贝尔化学奖。,PCR技术的原理,首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸和实验中提供的引物序列合成新生的DNA互补链。DNA解链（变性）引物与模板DNA相结合（退火）DNA合成（链的延伸）三步。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得1.8n。,将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。降低反应温度（退火，约50），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。将反应混合物的温度上升到72左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按53方向延伸，合成新生DNA互补链。,常规PCR技术能扩增两引物之间的DNA区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序列，这就需要应用反向PCR（reversePCR）技术。用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化DNA；产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过23kb，经连接后重新环化；按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指；左图为反向PCR的基本操作程序。波纹线表示靶DNA区段，箭头表示限制性内切酶位点，分别用方框表示靶DNA区段的左侧和右侧序列。,4、实时定量PCR（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR，利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。非序列特异性荧光染料SYBRGreenI,激发光波长520nm。左图为SYBRGreenI作探针的实时定量PCR实验过程图示,Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。下图为用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量。,为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5和3端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。随着PCR反应的进行，TaqMan探针结合到目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。,5、基因组DNA文库构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。构建基因组文库最常用的是噬菌体载体（克隆能力约15-20kb）和限制性内切酶部分消化法。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A，与BamHI是一对同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的噬菌体载体上。此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。,5.3RNA基本操作技术,真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5gRNA，其中：80%-85%为rRNA15%-20%为tRNA及sRNAmRNA约占总RNA的1%-5%rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280来判断。OD260为1时相当于浓度为40g/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/OD280的比值将明显低于1.8。,PolyATtractmRNA的分离纯化过程简图,由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA，complementaryDNA），再插入到可以自我复制的载体中。左图为cDNA合成过程示意图,定向cDNA合成及分子修饰因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA-mcrB-菌株以防止cDNA被降解。,cDNA文库的构建cDNA的长度一般在0.5-8kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用Uni-zapXR（一种噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（InVivoExcision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。,核酸杂交法：核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。80烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。,PCR筛选法将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。免疫筛选法该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。左图为噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图,5.4SNP的理论和应用,第11章再讲！,5.5基因克隆（clone）技术,在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotictwins）便是属于同一克隆。在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。,1、RACE技术（rapidamplificationofcDNAends）在已知cDNA序列基础上克隆5或3端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5端的方法称为5RACE，用于扩增3端的称为3RACE。5RACE在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（GSP1）启始cDNA第一条链合成。RNase降解模板链mRNA，纯化第一链。用末端转移酶在cDNA链3端加入连续的dCTP。以连有oligo(dG)的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，得到目的片段，用nestPCR检测。,3RACE1、用oligo(dT)锚定引物启始cDNA第一链的合成。2、降解模板mRNA。3、用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3片段，用nestPCR法检测。,2、cDNA差示分析法(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应后仅设置72复性与延伸，94变性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度高。,3、Gateway大规模克隆技术Gateway技术利用噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和