分子生物学课件-2-DNA的复制.ppt

染色质复制不包括任何延长期，此期间DNA与组蛋白分离。一旦DNA被复制，在两条复制链上核小体都很快形成。DNA复制也包含核小体颗粒的复制。,2.3DNA的复制,电镜照片显示一个刚复制的DNA区段，其两条子链上都已包装成核小体。,当染色质重建时，已经与核小体结合的DNA展开使两子链复制。那么，此位点上原来存在的核小体如何变化呢？组蛋白八聚体是解离成自由组蛋白重复使用，还是保持组装状态呢？原组蛋白八聚体没有被保留。解聚与重组的方式远不清楚。,核小体在DNA上的位置有特异性吗？现在已经清楚，组蛋白八聚体在DNA上组装并不是与序列无关的随机结合，有些情况下模式通过内部途径实现，定位取决于DNA的结构特征；有些情况下模式通过外部途径达成，定位取决于其它蛋白质与DNA或/和组蛋白的相互作用。,历史上曾经提出过DNA复制的3种假设,2.3.1DNA的半保留复制,In1958,MeselsonandStahlprovidedtheexperimentalproofforthesemiconservativemodelofDNAreplication（著名实验：用同位素标记，密度梯度离心。）大肠杆菌在含有15NH4Cl为唯一氮源的培养基上生长多代，这时DNA中的嘌呤和嘧啶中的氮几乎全是15N。然后将大肠杆菌转移到含有14NH4Cl的培养基中，在不同的间隔时间，收集细菌并裂解，提取DNA，并用CsCl梯度密度超速离心进行分析（这种方法可以分辨在密度上存在0.01g/mL差异的生物大分子）。,上述实验证明新合成的DNA同时含有15N和14N，因此DNA的复制不可能是全保留复制。为了证明DNA复制不是分散复制，MeselsonandStahl进行了进一步的实验，他们将15N标记的细菌在14N培养基上保持一代，然后提取DNA，加热到100度，使DNA双链变性为单链，再对变性的单链进行CsCl梯度密度超速离心，发现了两条分开的条带，表明一条链是15N标记的，另一条链是14N标记的，因此DNA复制是半保留复制，而不是分散复制。,在DNA复制过程中复制区域双螺旋解旋并分开，以每条单链为模板，按碱基互补配对原则，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。由于每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制。,DNA复制是半保留复制（semiconservativereplication),过程复杂；需要多种酶和蛋白质参与（包括拓扑异构酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等）。,DNA的复制-半保留复制,DNA半保留复制的生物学意义:DNAreplicationbysemi-conservationmakesthetwodaughterduplexeshavethesamesequenceastheparentalduplex.Thus,geneticmessageoforganismkeepsrelativestable.DNAismuchmorestablethanothercomponentsincell.Thisisconsistedwithitsfunctioncarrierofgeneticmessage.,Theoriginofreplication（复制起始点）：asequenceofDNAatwhichreplicationisinitiated（即DNA复制起始发生的位点）.复制从特定位点开始，双螺旋的两条链分开形成两条DNA模板，逐步向未复制部分扩大；刚分开的两条模板链与未复制的双链之间的连接区（即正在复制的分叉部位）称为复制叉（replicationfork）。Thereplicon（复制子）istheDNAunderthecontrolofoneoriginofreplication.AnypieceofDNAwhichreplicatesasasingleunitiscalledareplicon.（即具有一个复制起点,作为一个复制单位的DNA。）,2.3.2复制的起点、方向和速度,DNA链的复制过程示意图,DNA的单向复制只在噬菌体和某些质粒中观察到了,复制叉移动的方向和速度是多种多样的，但以双向等速移动为主。真核生物：双向等速原核生物：双向等速（大肠杆菌）双向不等速（枯草杆菌）先单向后双向（R6K质粒）单向（ColE1质粒）,AutoradiographofreplicatingBacillussubtilisDNA,Dormantbacterialspores（休眠的细菌孢子）weregerminatedinthepresenceoflow-radioactivityof3H-thymidine,sothenewlyformedreplicatingbublesimmediatelybecameslightlylabeled.Afterthebubleshadgrownsomewhat,moreradioactivity3H-thymidineswasaddedtolabeltheDNAforshortperiod.,J.HubermanandA.Tsaisexperiment:FruitflyDrosophilamelanogasterFirstwithhighlevelsof3H-thymidineSecondwithlightlevellabel,DNA的复制是由固定的起始点开始的（固定的序列），并识别参与复制起始的特殊蛋白；复制叉以DNA分子上某一特定序列为起点，移动的方向和速度多种多样，但以双向等速方式为主。,1线性DNA双链的复制,所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5向3端移动，新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是53；而对于DNA的合成必需一段引物的存在，体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必须切除，切除后，5端如何起始呢？,2.3.3复制的几种主要方式,延伸端粒是染色体末端的DNA重复序列，作用是保持染色体的完整性。DNA每次复制端粒就缩短一点。一旦端粒消耗殆尽，染色体则易于突变而导致动脉硬化和某些癌症。,通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如噬菌体（成环）、T7噬菌体（多聚分子）。DNA可形成特殊的结构。如草履虫的线性线粒体DNA在末端形成发夹，使分子没有游离末端。某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与5端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA。末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，DNA末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）。,?,二聚体,3-OH,3-OH,专一性核酸内切酶,T7噬菌体的末端复制,腺病毒通过蛋白引发的DNA复制,2环状DNA双链的复制,型（如大肠杆菌E.coli）,滚环型（rollingcircle）（如X174）,D-环形（D-loop）（如哺乳动物线粒体DNA）,2.4原核生物和真核生物DNA复制的特点,过程复杂；需要多种酶和蛋白质参与（包括拓扑异构酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等）。,2.4.1原核生物DNA复制的特点,1.1解旋酶（helicase)DNA复制时，解旋酶利用ATP的能量启动DNA解旋，使双连分开形成单链。,1.DNA双螺旋的解旋,在Ecoli中，解旋酶DnaB作为引发体的成员，参与复制叉形成，并结合于一个复制叉，利用ATP水解的能量解开双螺旋，推动复制叉向前延伸;大部分DNA解链酶可沿后随链的5-3方向随着复制叉的前进而移动，Rep蛋白则沿前导链模板的3-5方向移动。生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与DNA修复，重组等非复制过程。,1.2拓扑异构酶（topoisomerase)可以使DNA的两种拓扑异构体互变的酶。DNA分子在细胞内以超螺旋形式存在，DNA拓扑异构酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间转变。,功能：与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯键断裂，形成DNAnick，DNA的一条链进行解旋旋转而改变DNA分子的拓扑状态。v参与复制、转录、重组。,效应：拓扑异构酶可使DNA发生：连环化（catenate)脱连环化(decatenate)打结（knot)解结（unknot),解旋酶沿着复制叉向前延伸产生了一段单链，细胞内大量的单链结合蛋白能和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链。,1.3单链结合蛋白（SSB）,SSB的作用：v使DNA单链保持一种伸展构象，它们与磷酸骨架结合，离开暴露的碱基，此次那些碱基能作为DNA合成的模板；v使解开的单链不形成发卡结构；v保护DNA单链不受Dnase水解。,2DNA复制的引发,oriC(84min),（dnaA结合位点）,此序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。,oriC在不同原核生物中有同源性，很多细菌的oriC区在结构上相似的，在序列上有相当的保守性，而且在分类上越接近的细菌其同源性越高，表明DNA复制起点的重要性。,将DNA分子的复制起始位点（复制器）连接到任何一个DNA分子上，都能起始其复制。,起始蛋白与特异序列结合、促进解旋和引发体组装,引发体是由很多蛋白质因子参与形成的。,只有当引发前体把这6种蛋白质合在一起并与引发酶进一步组装后形成引发体，才能发挥其功效。,4.3.4引发酶（Primase，或引物酶),DNA合成时需要一段大约6-10个核苷酸长的RNA，作为DNA合成的引物；这段引物是由引物酶合成的。是在特定环境下发挥作用的RNA聚合酶，仅用于合成DNA复制所需的一小段RNA。引物酶以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸直接从头合成RNA引物（6-10nt)。,减少致死突变。DNA合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物RNA随后被降解，从而减少了复制错误。,引物的意义：,引物酶催化引物RNA的合成，但它不同于RNA聚合酶。引物酶只在复制起点处合成RNA引物以引发DNA复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA，从而将遗传信息由DNA传递到RNA。,E.coli的引物酶由一条肽链组成，分子量为60KD,DnaG基因编码。,DnaAproteinmoleculesbindstothefour9bprepeatsintheorigin，thenrecognizesandsuccessivelydenaturestheDNAintheregionofthethree13bprepeats,whicharerichinA=TpairsThisprocessrequiresATPandthebacterialhistonelikeproteinHU.HUpreventsnonspecificinitiationatsitesotherthanoriCTheDnaAproteinthenmediatestheseparationofthestrandsoftheDNAduplexbyactingonthreeAT-richtandemrepeatslocatedatthe5-endofthesequencedefiningoriCFormationofthis45-bp“opencomplex”byDnaAproteinisATP-dependent.,DnaBprotein(ahexamerof50-kDsubunits)bindstothe“open”oriC.DnaBproteinisdeliveredtooriCbyDnaCproteinassistedbyDnaTprotein.TheadditionofDnaBproteincompletesassemblyofthepre-primingcomplex（引发前体）.ATPhydrolysisdrivestheformationofthiscomplex.DnaBproteinhashelicaseactivityanditfurtherunwindstheDNAinthepre-primingcomplexinbothdirectionsSSBtetramerscoatsinglestrandedregionsastheyarise.,引物酶（）结合到引发前体上组装成了引发体（primosome）。在SSB和拓扑异构酶的参与下，引发体可在单链上移动，在的帮助下，识别复制的起始起点位置。,引发体在复制叉先合成先导链的RNA引物，再合成后滞链的引物（PrimaseassociationwithDnaBistransient;onceaprimerhasbeensynthesized,primasedissociatesuntilanotherroundofprimersynthesisisnecessary.)在复制叉DNApolymeraseIII组装成非对称的二聚体，它催化第一个按碱基互补配对原则加在引物的端，而进入链的延伸阶段.,3冈崎片段与半不连续复制,冈崎片段(Okazakifragment)一般长约1000-2000个碱基，原核比真核长。,前导链Leadingstrand后随链Laggingstrand,然后，RNaseH降解RNA引物，DNA聚合酶I补齐缺口，再由DNA连接酶连接两个冈崎片段。,4.复制的终止,在E.coliDNA上存在着复制的终止位点;终止位点的序列Ter():AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCA,终止序列可被tus蛋白（tus基因编码）识别，并结合于其上；Ter-Tus复合物能使DnaB不再将DNA解链，使复制叉停止前移；E.coli两个复制叉在相距100kb时，复制速度减慢从而协调两个复制叉到达时间。Tusprotein只让一侧复制叉通过，使DNA的复制在终点位置终止。,复制终止的协调：在Forksmeet两侧各有几个段序列如：terE.D.A.terC.B。当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在ter位点停止，等待直到慢侧跟上。以上似乎构成一个“replicationforktrap”,E.coliDNA复制到最后，子代DNA链套在一起,由DNA拓扑异构酶II切开双链将两个DNA分子分开成为两个完整地与亲代DNA分子完全一样的子代DNA分子。,5DNA聚合酶,细菌中，已有五种DNA聚合酶被发现。*DNA聚合酶I（PolI）：C端(Klenow片段)具有聚合酶活性和3-5外切酶活性；N端具有5-3外切酶活性。这三种不同的活性存在于酶的三个分开的活性中心上。3-5外切酶活性与DNA聚合酶的校正功能有关。53的外切活性在DNA损伤的修复中可能起其重要作用。对冈崎片断5端RNA引物的去除，依赖此种外切酶活性。,DNA聚合酶I不是主要的复制酶,而是在DNA修复中起作用,*DNA聚合酶II（PolII）：活性低，在DNA损伤修复中起作用。*DNA聚合酶III（PolIII）：活性强，具有聚合酶活性和3-5外切酶活性，在大肠杆菌DNA复制过程中起主要作用。*DNA聚合酶IV（PolIV）：SOS修复中发挥作用。*DNA聚合酶V（PolV）：SOS修复中发挥作用。,6DNA连接酶（ligase)催化双链DNA切口处的5-磷酸和3-羟基生成磷酸二酯键;连接反应需要供给能量。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源;动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。,DNA滞后链上的复制是不连续的，各合成的片段需要连接酶连接，连接酶的反应条件：v被连接的两链必须与另一链（模板链）互补；v两链相邻；v每次只能连接一个缺口；使一条链的5-P与另一链的3-OH形成磷酸二酯键；缺口缺失核苷酸不连接。,T4Ligase特性：v可连接DNA与DNA，也可连接RNA与RNA。可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切口和齐末端切口。T4Ligase可作为重组工具酶。,T4连接酶,T4连接酶,2.4.2真核生物DNA复制的特点,真核生物是多点复制，原核生物是单点复制。真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的DNA复制。复制起始位点：自主复制序列(autonomousreplicatingsequence,ARS)这个序列是染色体正常起始复制所必需的。所有的ARS的DNA均有一段保守序列：-A(T)TTTAT(C)A(G)TTTA(T)-ARS能结合起始点识别复合物(originrecognitioncomplex,ORC)。,已发现15种真核DNA聚合酶，在哺乳动物细胞中有5种：Po