分子生物学检测..ppt

福州艾迪康PCR实验室介绍陈衍娇,聚合酶链反应(PCR)技术,PCR发展简史PCR基本概述PCR基本原理,PCR发展简史,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）1993年，Higuchi等报道了实时PCR(real-timePCR),PCR基本概述,聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。,PCR基本原理,PCR扩增基本要素PCR扩增过程,PCR扩增基本要素,DNA引物,DNA模板,TaqDNA聚合酶,dNTP,缓冲液,Mg2+,PCR扩增参数,温度与时间参数（1）变性温度与时间（2）退火温度与时间（3）延伸温度与时间循环次数,PCR基本扩增过程,实时定量荧光PCR技术,实时荧光PCR基本原理Taqman实时荧光PCR基本原理双杂交探针实时荧光PCR基本原理,Taqman实时荧光PCR基本原理,靶DNA,5,3,TaqMan探针,淬灭剂,报告荧光,引物,PCR过程中,TaqMan探针和引物与靶序列退火,5,5,3,3,靶DNA,引物,TaqMan探针,报告荧光,淬灭剂,引物在Taq酶的聚合延伸下,其5外切酶活性将水解探针,从而使荧光基团脱离淬灭剂的作用而发出荧光,双杂交探针实时荧光PCR基本原理,靶DNA,供体荧光基团,5,5,3,3,受体荧光基团,5,3,靶DNA,3,3,5,5,实时荧光定量PCR工作流程,标本的采集标本的运送标本的处理基因扩增扩增产物分析,标本的采集,标本采集时间对扩增检测结果的影响标本采集部位的准备标本采集的类型和采集量采样质量的评价采样及运输容器标本采集中的防污染,PCR实验室设置,试剂准备区(区)标本处理区(区)扩增分析区(区)产物分析区(区),实时荧光定量PCR的应用我们福州PCR主要检测项目,1.乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)2.人乳头瘤病毒HPV23型、人乳头瘤病毒6/11、人乳头瘤病毒16/183.沙眼衣原体DNA、解脲支原体DNA、淋球菌DNA4.丙型肝炎RNA,乙型肝炎病毒(HBV)PCR检测,乙型肝炎病毒(HBV)概述乙型肝炎病毒基因区乙型肝炎病毒临床意义乙型肝炎病毒变异检测,乙型肝炎病毒(HBV)概述,乙肝病毒是已知最小的部分双链的环形DNA病毒，长3.2kb，有高度重叠的4个基因区，编码至少8种蛋白。即S基因编码的大、中、小HBs；C基因的前C、HBc、HBe；P基因的聚合酶和X基因的HBx。,乙肝病毒结构图,乙型肝炎病毒基因区,S区C区P区X区,乙型肝炎病毒临床意义,判断肝病的病情、预后和传染性预测抗病毒治疗的效果监测和评价抗病毒药物的疗效,乙型肝炎病毒YMDD变异,YMDD:酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸YIDD突变：蛋氨酸异亮氨酸YVDD突变：蛋氨酸缬氨酸,人乳头瘤病毒（HPV）PCR检测,人乳头瘤病毒的概述人乳头瘤病毒的型别与分布人乳头瘤的致癌机理人乳头瘤病毒检测的临床意义人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的关系理想的宫颈癌筛查,人乳头瘤病毒的概述,双链DNA无包膜病毒环状DNA，约8Kb；病毒颗粒直径为5055nm；依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。游离在细胞内，持续存在，不引起任何病变，或引起良性病变和低度病变，如尖锐湿疣或轻度不典型增生等。而癌变则与病毒DNA整合入染色体密切相关。HPV感染是否发病取决于被感染的细胞是否进行成熟分化。,HPV病毒电镜图,人乳头瘤的型别与分布,型别已发现100多种不同的亚型，其中超过40种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV6、11、42等）2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66及68等）分布有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52，58在中国常见。在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51），在腺癌和腺鳞癌中HPV18分别占56和39。,人乳头瘤病毒的致癌机理,HPV的基因结构人乳头瘤病毒HPV的基因结构按功能可分为早期区（E区）、晚期区（L区）和非编码区（LCR）三个区域HPV的致癌机理,人乳头瘤病毒检测的临床意义,低危型1）预防和提示外生殖器湿疣等良性性病。2）可用于临床可疑尖锐湿疣患者的确诊，及HPV感染的早期诊断。高危型1）女性常规体检，评估宫颈癌发生的可能性。2）跟进宫颈癌的疗效，评估宫颈癌复发的可能性。,人乳头瘤病毒和宫颈癌的关系,早在十九世纪四十年代，一位意大利医生RegoniStern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关。1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）颗粒。至89年左右，约翰.霍普金斯大学教授KeertiShah证实子宫颈癌与HPV感染有直接关系。1995年世界卫生组织国际癌症研究所（IARC）专题讨论会认为：HPV感染是宫颈癌发生的主要病因。,理想的宫颈癌筛查,临床提示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。因此，必须采取适当的预防和筛查措施，才能够阻止宫颈癌的发生并有望最终根治。美国肿瘤临床指导：性行为开始三年左右，不晚于21岁开始。每年筛一次。若23次HPV和细胞学筛查均为正常者，可延长筛查时间至5-8年。大于70岁，在10年内已有3次以上满意的细胞学检查和HPV检查正常者，可停止筛查。良性子宫切除患者不需要检查，否则，连续3年检查，可终止。中国：筛查起始年龄可考虑为25-30岁，65岁以上可停止筛查。,附：中国癌症研究基金会（CCRF）筛查和早诊早治指南,基本方案：肉眼观察冰醋酸试验（碘液试验）一般方案：papsmear+HPV检测最佳方案：TCT+HPV检测,附：理想的宫颈癌筛查方案,HPV检测（）细胞学检查（）58年复查HPV检测（）细胞学检查（）HPV检测（）细胞学检查（）阴道镜检查每年复查组织学检查HPV检测（）细胞学检查（）,丙型肝炎病毒PCR检测,丙型肝炎病毒的概述丙型肝炎病毒RNA检测的临床意义,丙型肝炎病毒的概述,丙肝病毒是一种直径不到80纳米，有包膜的单股正链核糖核酸（RNA）病毒，属于黄病毒科家系。丙型肝炎病毒有6个基因型，其中以型、型和型最为常见。丙肝病毒不能自己合成蛋白，所以感染人体后常“借用”人体细胞的蛋白合成机制来合成病毒的蛋白。丙肝病毒在肝细胞内复制时，不仅利用人体细胞的蛋白合成机制，而且常引起肝细胞结构和功能改变或干扰肝细胞蛋白合成，造成肝细胞变性坏死。丙肝病毒的核心蛋白与致癌有关。,丙肝病毒结构图,丙型肝炎病毒RNA检测的临床意义,判断肝病的病情、预后和传染性预测抗病毒治疗的效果监测和评价抗病毒药物的疗效,人类巨细胞病毒PCR检测,人类巨细胞病毒概述人类巨细胞病毒PCR检测的临床意义,人类巨细胞（CMV）病毒的概述,CMV又称为涎病毒，属于疱疹病毒亚科，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。由分子量约为150X106的线状双股DNA所组成。其形最大由162个壳粒（capsomer），正20面体构成。有典型的疱疹病毒结构。形态与单纯疱疹病毒及水痘-带状疱疹病毒非常相似，不易区别。CMV只能在人纤维母细胞的组织培养中增殖，而不能在其他动物细胞中生长，增殖非常缓慢，其复制周期为36-48小时，比单纯疱疹病毒复制周期8小时要长得多。初次分离需一个多月才能出现特殊的细胞；细胞变园，膨胀，细胞及核巨大化，核周围出现一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。在活体中的靶细胞主要是上皮细胞。人类CMV各株之间有广泛交叉反应。,巨细胞病毒显微镜下图片,人类巨细胞病毒PCR检测临床意义,预防胎儿畸形的可能性用于人巨细胞病毒感染的辅助诊断和人巨细胞病毒感染病人药物治疗的疗效监控。,结核分支杆菌PCR检测,结核分支杆菌概述结核分支杆菌PCR检测临床意义,结核分支杆菌概述,结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小14X0.4?m。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸(mycolicacid)包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。分枝杆菌一般用齐尼（Ziehl-Neelsen)抗酸染色法，以5%石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。,抗酸染色后的结核杆菌,结核分支杆菌PCR检测临床意义,为结核病的早期辅助诊断以及结核病高危人群的初筛等提供分子生物学上的参考依据。,其他性病PCR检测,沙眼衣原体PCR检测解脲支原体PCR检测单纯疱疹病毒型PCR检测淋球菌PCR检测,沙眼衣原体PCR检测,沙眼衣原体的概述沙眼衣原体PCR检测的临床意义,沙眼衣原体概述,沙眼衣原体是一类在细胞内寄生的微生物，大小约250-450nm。分为3个生物型，小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿生物型（LGV型）。后二者与人类疾病有关。用间接微量免疫荧光试验，沙眼生物型又分A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K14个血清型，LGV生物型又有L1、L2、L2a、L34个血清型。,沙眼衣原体PCR检测临床意义,为沙眼衣原体的早期辅助诊断以及沙眼衣原体高危人群的初筛等提供分子生物学上的参考依据。,解脲支原体PCR检测,解脲支原体的概述解脲支原体PCR检测的临床意义,解脲支原体的概述,解脲支原体（M.urealyticum）为脲原体属中唯一的一个种，因生长需要尿素而得名。菌落微小，直径仅有1525um，须在低倍显微镜下观察，故旧称T株(tinystrain)。菌落表面有粗糙颗粒，在合适条件下可转成典型的荷包蛋样菌落。生长需要胆固醇和尿素，分解尿素为其代谢特征，产生氨氮，使培养基pH上升，患者小便往往带有臊腥味。,低倍显微镜下观察解脲支原体,解脲支原体PCR检测临床意义,为解脲脲原体的早期辅助诊断以及解脲脲原体高危人群的初筛等提供分子生物学上的参考依据。,单纯疱疹病毒PCR检测,单纯疱疹病毒的概述单纯疱疹病毒PCR检测的临床意义,单纯疱疹病毒概述,单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus）属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。根据抗原性的差别目前把该病毒分为1型和2型。1型主要由口唇病灶获得，2型可从生殖器病灶分离到。感染是由于人与人的接触。从发生后四个月到数年被感染的人数可达人口总数的5090%，是最易侵犯人的一种病毒，但在临床仅有一部份发病。此病可分为：口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹、卡波西病等，有时也是脑膜炎、脑炎的病因。口唇部疱疹一般较易诊断，同时因日晒、发热等种种的刺激因素而引起复发。该病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上及人、猴、鸡等的动物培养细胞中大量地增殖。另外，2型病毒对田鼠细胞等有转化作用。还怀疑疱疹病毒与人类的宫颈癌有关。,染色后的单纯疱疹病毒,单纯疱疹病毒PCR检测临床意义,用于单纯疱疹病毒感染的辅助诊断及其感染病人的药物治疗的疗效监控。,淋球菌病毒PCR检测,淋球菌病毒的概述淋球菌病毒PCR检测的临床意义,淋球菌概述,淋球菌（gonococcus）有严格的人类寄生性，属于奈瑟菌属，为革兰阴性双球菌，常成对排列，邻近面扁平或稍凹陷，形成氧化酶阳性的菌落，其致病性可能与细菌表面物质即粘附因子和菌毛的作用有关。带菌毛的细菌具有毒力，可引起感染，无菌毛的细菌无毒力，不产生炎症。菌毛可粘附于各种上皮细胞，