分子生物学常用技术PPT课件

分子生物学常用技术,第十七章,.,分子生物学常用技术,凝胶电泳分子杂交聚合酶链反应(PCR)技术DNA的物理图谱DNA序列测定基因芯片,.,第一节凝胶电泳(gelelectrophoresis),电泳概念基本原理Q6r:迁移率Q:电荷量r:粒子半径（分子量）:介质粘度,.,电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,.,一、琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis),分离核酸原理操作要点应用范围,.,（一）分离核酸原理,电荷效应分子筛效应分子构象,.,1.电荷效应,核酸是两性电解质pH=3.5,正电荷pH=8.08.3,负电荷，正极,.,.,2.分子筛效应,小分子移动快，大分子移动慢,.,3.分子构象,闭环超螺旋线状DNA开环DNA,+,-,.,（二）操作要点,支持物凝胶浓度的选择DNA分子量标准电泳缓冲液样品制备电泳条件DNA电泳染色DNA片段的回收,.,1.支持物,.,商品化的琼脂糖,.,琼脂糖种类,.,2.凝胶浓度的选择,.,凝胶的制备,.,.,.,3.DNAmarker,.,DNAmarker,.,DNA长度标准曲线,.,4.电泳缓冲液,Tris-乙酸(TAE)pH8.0Tris-硼酸(TBE)pH8.0Tris-磷酸(TPE)pH8.0,.,5.样品制备,上样缓冲液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚蓝/二甲苯青,.,点样,.,6.电泳条件,潜水电泳恒压电泳低压:12V/cm中压:810V/cm高压电泳：几十V/cm温度：1525,.,潜水电泳,.,7.电泳染色,溴乙锭(ethidiumbromide,EB)结构及染色原理染色方法加入凝胶液中电泳结束后染色,.,EB染色原理,.,.,紫外灯下显色,.,8.DNA片段的回收,低熔点琼脂糖法透析袋电洗脱法(5kb)DEAE-纤维素膜法(0.55kb),.,（三）应用范围,DNA的分离、纯化和鉴定限制性酶切图谱分析重组体的分离、鉴定杂交分析PCR产物的分离鉴定,.,琼脂糖凝胶电泳,.,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE),分离原理操作要点优点应用范围,.,（一）分离原理,电荷效应分子筛效应,.,PAGE支持物,单体丙烯酰胺(Acr)交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)催化剂过硫酸胺(AP)加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED),.,聚丙烯酰胺凝胶,.,（二）操作要点,凝胶的分类凝胶浓度的选择凝胶液的配制凝胶中DNA的检测DNA片段的回收,.,1.凝胶的分类,非变性凝胶：dsDNA变性凝胶:ssDNA尿素甲酰胺SDS,.,2.凝胶浓度的选择,.,.,3.凝胶液的配制,.,PAGE装置,.,.,.,.,电泳,.,4.凝胶中DNA的检测,溴乙锭染色法银盐染色法甲醛还原放射自显影法,Ag+DNA,Ag（黑褐色）,.,5.DNA片段的回收,压碎浸泡法1kb纯度高，回收率低,.,（三）PAGE优点,机械强度好、化学稳定性高分辨率高载样量大回收的DNA纯度高,.,（四）PAGE应用范围,分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNADNA序列分析PCR产物鉴定蛋白质的检测和分析,.,第二节分子杂交,分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术,.,一、分子杂交的基本原理,核酸的变性和复性,.,分子杂交,DNA-DNA,.,DNA-RNA,.,杂交条件,靶分子探针杂交袋杂交炉,.,杂交种类,被检核酸种类和方法原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交反应介质液相杂交固相杂交(),.,二、固相支持物,固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固非特异性吸附少机械性能良好,.,固相支持物的种类,硝酸纤维素滤膜(nitrocellulosefiltermembrane)尼龙膜(nylonmembrane),.,1.硝酸纤维素滤膜,特点吸附ssDNA和RNA杂交信号本底低不足不适于重复杂交滤膜较脆不适于电转移印迹法对DNA小片段(缺口翻译操作简便DNA/cDNA探针,.,.,DNA的5末端标记(5endlabeling),碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶标记原理制备寡核苷酸探针制备短的DNA/RNA探针,.,DNA的5末端标记,.,四、Southern杂交,Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印迹(blotting):转移blot:aspotormark,esp.ofinkblotting,.,1.印迹的方法,毛细管转移法电转移法真空转移法,.,毛细管转移法,.,电转移法,.,真空转移法,.,.,2.Southern杂交的步骤,.,3.Southern杂交的应用,基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析RFLP,.,五、Northern杂交,RNAblotting步骤总RNA/mRNA变性电泳分离转移杂交放射自显影/化学显色应用检测组织/细胞中mRNA的大小、量比较不同组织/细胞中基因的表达情况,.,Northern杂交,.,六、Western杂交,免疫印迹(immunoblotting)SDS-PAGE转移蛋白第一抗体标记的第二抗体(探针)检测应用-蛋白质的定性定量分析,.,.,免疫印迹,.,Southern,Northern34kb,34min;10kb,15min循环次数:2535,.,四、PCR的种类,反转录PCR原位PCR(insituPCR)实时PCR(realtimePCR)重组PCR(recombinantPCR)锚定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR),.,原位PCR,原位杂交PCR程序固定细胞/组织样品PCR前处理PCR扩增原位杂交及检测,.,实时PCR的原理,.,五、PCR的应用,分子生物学研究临床医学,.,分子生物学研究,基因克隆DNA序列测定基因的体外定点突变突变分析(PCR-SSCP)基因定量,.,临床医学,病原体诊断遗传病的基因诊断肿瘤检测法医学,.,第四节DNA序列测定,Sanger双脱氧链终止法(1977)Maxam-Gilbert化学裂解法(1977),.,Sanger双脱氧链终止法,原理DNA复制反应条件模板引物dNTP（其中一种带放射性标记）ddNTPDNA聚合酶,.,DNA的复制,.,2,3-双脱氧核苷酸(ddNTP),.,.,.,DNA测序操作,.,DNA自动测序,.,DNA自动测序仪,.,第六节生物芯片(Biochip),20世纪90年代末生物分子之间相互作用的特异性种类细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、基因芯片、蛋白质芯片,.,基因芯片,概念种类应用领域表达谱基因芯片及其检测原理应用举例,.,什么是基因芯片？,基因芯片(Genechip,DNAchip),又称为DNA微阵列(DNAMicroarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将大量寡核苷酸或cDNA有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。,.,基因芯片,.,芯片的制备,.,基因芯片的种类,表达谱基因芯片诊断芯片检测芯片,.,基因芯片的应用领域,基因芯片,基因表达谱,疾病诊断,药物筛选,新基因寻找,测序,基因分