PCR操作技术大全

聚合酶链式反应技术概述，聚合酶链式反应原理，样品变性初级聚合酶链式反应延伸，聚合酶链式反应产物，聚合酶链式反应曲线，标准聚合酶链式反应体系，10个扩增缓冲液10ul4四种脱氧核糖核酸混合物每种200微升引物10 10 100微升模板DNA 0.1 2 UGTAQDNA聚合酶2.5微升2.5微升1.5微升向100微升中加入双蒸水或三蒸水，聚合酶链式反应五要素，引物酶DNTP (DATP，DGTP，DCTP，dTTP)模板Mg2(镁PCR产物的特异性取决于引物和模板DNA之间的互补程度。理论上，只要模板DNA序列的任何片段是已知的，互补的寡核苷酸链可以被设计为引物，并且模板DNA可以在体外通过聚合酶链反应被大量扩增。引物设计原则(1)，(1)引物38分子长度：15-30bp。常用引物的有效长度约为20米。否则，最佳延伸温度将超过TaqDNA聚合酶的最佳温度(74)。聚合酶链反应扩增产物的特异性无法保证(2)引物扩增跨度：在特定条件下可扩增至10kb的片段适用于500bp (3)引物碱基：40-60%的碳含量适用于碳含量过少的扩增效果不好，当碳含量过多时容易出现非特异性条带ATGC，最好随机分布，避免5个以上嘌呤或嘧啶核苷酸的串排列， 引物设计原则(2)、(4)避免了引物内部的二级结构，避免了两个引物之间的互补，尤其是3端的互补，否则将形成引物二聚体，且引物3端的碱基的非特异性扩增带(5)需要严格配对，尤其是最后和倒数第二个碱基， 为了避免因末端碱基错配而导致的聚合酶链反应失败(6)，用或能够在引物中添加合适的限制性位点而扩增的靶序列优选具有合适的限制性位点，这对于酶消化分析或分子克隆非常有利。 底漆设计原则(三)。引物特异性：引物应与核酸序列数据库中的其他序列无明显同源性引物数量：每条引物的浓度为0.1-1 UMOL或10-10100pmol。最低引物量所需的结果是高引物浓度将导致错配和非特异性扩增，并增加引物间二聚体形成的机会。底漆设计原则(四)。应特别注意逆转录-聚合酶链反应引物设计：跨越两个外显子，酶及其浓度，目前有两个TaqDNA聚合酶提供天然酶：从嗜热杆菌中纯化基因工程酶：大肠杆菌需要约2.5U的酶(当总反应体积为100微升)用于典型的聚合酶链反应。浓度过高会导致非特异性扩增，而浓度过低会降低合成产物的量。脱氧核糖核酸的质量和浓度、脱氧核糖核酸的质量和浓度与聚合酶链反应扩增效率密切相关。由于储存不当，dNTP呈颗粒状，变性的dNTP溶液呈酸性。使用时，应将其配制成高浓度，然后用1MNaOH或1MTris-HCl缓冲液调节其酸碱度至7.0 7.5，并少量包装，在-20下冷冻。在聚合酶链反应中，脱氧核糖核酸的浓度应为50 200微升/升，尤其是四种脱氧核糖核酸的浓度应相等(等摩尔制备)。如果任何浓度不同于其他浓度(更高或更低)，将导致不匹配。如果浓度太低，会降低聚合酶链反应产物的产量。dNTP可与Mg2结合，降低游离Mg2的浓度。模板(靶基因)、模板核酸的数量和纯化程度是聚合酶链反应成败的关键环节之一。SDS和蛋白酶K通常用于传统的DNA纯化方法，以消化和处理样品。SDS的主要功能是溶解细胞膜上的脂质和蛋白质。因此，膜蛋白被溶解以破坏细胞膜并解离细胞中的核蛋白。SDS还可以与蛋白质结合，沉淀蛋白酶K，蛋白酶K可以水解和消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。然后用有机溶剂苯酚和氯仿提取蛋白质和其他细胞成分。乙醇或异丙醇用于沉淀核酸、模板(靶基因)，提取的核酸可用作一般临床检测样品中聚合酶链反应的模板。快速简单的方法可用于裂解细胞、裂解病原体、消化和去除染色体上的蛋白质以释放靶基因。异硫氰酸胍或蛋白酶k法一般用于聚合酶链反应扩增核糖核酸模板的提取。为防止核糖核酸酶降解核糖核酸，Mg2浓度，Mg2对聚合酶链反应扩增的特异性和产量有显著影响。在一般的聚合酶链反应中，当NTP浓度为200毫摩尔/升时，Mg2的浓度为1.5-2.0毫摩尔/升。Mg2的浓度过高是合适的，反应特异性降低，并且发生非特异性扩增。如果浓度太低，TaqDNA聚合酶的活性将降低，反应产物将减少。聚合酶链式反应条件的选择、聚合酶链式反应条件：的温度-时间循环次数、温度和时间的设定如下：在设定变性、退火和延伸三个温度点的标准反应中采用三温度点法。双链DNA在90-95变性，然后快速冷却至40-60，引物退火并与靶序列结合，然后快速加热至70-75。对于短的靶基因(长度为100-300 BP时)，可以采用双温点法，退火和延伸温度合二为一。通常，采用94变性、约65退火和拉伸。变性温度和时间：变性温度低和解链不完全是导致聚合酶链反应失败的主要原因。一般来说，93 94的lmin足以使模板DNA变性。如果低于93，则需要延长，但温度不能太高，因为高温环境会影响酶的活性。如果目标基因模板或聚合酶链反应产物在此步骤中不能完全变性，聚合酶链反应将失败。退火(复性)温度和时间：退火温度是影响聚合酶链反应特异性的一个更重要的因素。变性后，温度可迅速冷却至40 60，使引物和模板结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会比模板互补链之间的碰撞退火温度和时间高得多，这取决于引物的长度、碱基组成和浓度以及靶碱基序列的长度。对于含20个核苷酸、含碳量约为50%的引物，55是选择最佳退火温度的理想起点。引物的复性温度有助于通过以下公式选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4 (g c) 2 (a t)复性温度=Tm值-(5 10)，在Tm值的允许范围内。选择较高的复性温度可以大大降低引物与模板之间的非特异性结合，而聚合酶链反应的特异性复性时间一般为30 60秒，足以将引物与模板完全结合。延伸温度和时间：70 80 150个核苷酸/秒/酶分子7060个核苷酸/秒/酶分子5524个核苷酸/秒/酶分子的生物学活性高于90，很难进行DNA合成；延伸温度和时间：延伸温度：一般情况下，选择70 75之间常用的72的高延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段的长度确定1Kb以内的DNA片段；延伸时间为1分钟(足够)3-4 kb的靶序列需要扩增3-4分钟，10Kb需要延伸15分钟。延长延伸时间将导致低浓度模板的非特异性扩增，并且延伸时间将稍长，具有循环时间。循环次数决定了聚合酶链反应扩增的程度。循环次数主要取决于模板DNA的浓度：在30至40个循环中选择的循环越多，加入的非特异性产物就越多。聚合酶链反应具有特异性强、灵敏度高、简便快速、对样品纯度要求低、特异性强的特点。关键：引物和模板的正确结合引物和模板的结合以及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的合成反应的保真度和TaqDNA聚合酶的耐高温性，因此模板和引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，扩增的靶基因片段也可以保持较高的准确性。通过选择特异性和保守性高的目标基因区域，特异性程度更高，是聚合酶链反应的特异性决定因素，引物和模板DNA特异性正确结合；碱基配对原则；TaqDNA聚合酶合成反应的忠诚度；目标基因的特异性和保守性高，灵敏度高，聚合酶链反应产物的产生量以指数方式增加，待检测的初始模板数量级为pg (pg=10-12)可扩增至微克(ug=10-6)水平，从100万个细胞中检测到一个目标细胞，在病毒检测中，聚合酶链反应的灵敏度可达3 RFU(噬斑形成单位)，细菌学中最低检出率为3个细菌，简单、方便、快速。耐高温的聚合酶链反应。反应液加入一次