1有关HPLC的知识.ppt

HPLC的常用术语及符号,第一部分色谱曲线1、色谱图（chromatogram）：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。2、（色谱）峰（chromatographicpeak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。,3、峰底（peakbase）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1中的CD）。4、峰高（h，peakheight）：色谱峰最大值点到峰底的距离（图1中的BE）。5、峰宽（W，peakwidth）：在峰两侧拐点（图1中的F，G）处所作切线与峰底相交两点的距离（图1中的KL）。6、半高峰宽（Wh/2，peakwithdathalfheight）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离（图1中的HJ）。,7、峰面积（A，peakarea）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。8、拖尾峰（tailingpeak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。9、前伸峰（leadingpeak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）,10、假峰（ghostpeak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）11、畸峰（distrortedpeak）：形状不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。12、反峰（negativepeak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。,13、基线（baseline）：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的响应信号曲线。14、基线漂移（baselinedrift）：基线随时间定向的缓慢变化。15、基线噪声（N，baselinenoise）：由于各种原因而引起的基线波动。,第二部分分离模式,3、峰底（peakbase）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1中的CD）。4、峰高（h，peakheight）：色谱峰最大值点到峰底的距离（图1中的BE）。5、峰宽（W，peakwidth）：在峰两侧拐点（图1中的F，G）处所作切线与峰底相交两点的距离（图1中的KL）。,6、半高峰宽（Wh/2，peakwithdathalfheight）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离（图1中的HJ）。7、峰面积（A，peakarea）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。8、拖尾峰（tailingpeak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。,9、前伸峰（leadingpeak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）10、假峰（ghostpeak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）11、畸峰（distrortedpeak）：形状不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。12、反峰（negativepeak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。,第三部分HPLC的分类,、液相色谱法（liquidchromatography，LC）：用液体作流动相的色谱法。2、液液色谱法（liquidliquidchromatography，LLC）：将固定液涂渍在载体上作为固定相的液相色谱法。、液固色谱法（liquidsolidchromatography，LSC）：用固体（一般指吸附剂）作为流动相的液相色谱法。,、正相液相色谱法（normalphaseliquidchromatography，NPLC）：固定相的极性较流动相的极性强的液相色谱法。、反相液相色谱法（reversedphaseliquidchromatography，RPLC）：固定相的极性较流动相的极性弱的液相色谱法。6、柱液相色谱法（liquidcolumnchromatography）：在柱管内进行组分分离的液相色谱法。,7、高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）：具有高分离效能的柱液相色谱法。、尺寸排除色谱法（sizeexclusionchromatography，SEC）：用化学惰性的多孔性物质作为固定相，试样组分按分子体积（严格来讲是流体力学体积）进行分离的液相色谱法。9、凝胶过滤色谱法：（gelfiltrationchromatography）：水或水溶液作为流动相的体积排除色谱法。,10、凝胶渗透色谱法：（gelpermeationchromatography，GPC）：有机溶剂作为流动相的体积排除色谱法。11、亲和色谱法（affinitychromatography）：用连接在基体上的配位体做固定相，使其与蛋白质或其他大分子发生可逆的高选择性的相互作用，利用不同亲和力进行分离的液相色谱法。12、离子交换色谱法（ionexchangechromatography，IEC）：以离子交换作用分离离子型化合物的液相色谱法。,13、离子色谱法（ionchromatography）：以含有某种特定离子的水溶液作为流动相，流出液通过抑制柱（或不通过抑制柱），在降低流动相背景信号的条件下用于分离离子的液相色谱法。14、离子抑制色谱法（ionsuppressionchromatography）：通过调节流动相的PH值来抑制试样组分的电离，以分离离子型化合物的液相色谱法。15、离子对色谱法（ionpairchromatography）：用形成离子对化合物进行分离的液相色谱法。,16、疏水作用色谱法（hydrophobicinterationchromatography）：用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相，借疏水作用分离生物大分子化合物的液相色谱法。17、制备液相色谱法（preparativeliquidchromatography）：用能处理较大量试样的色谱系统，进行分离、切割和收集组分，以提纯化合物的液相色谱法。18、平面色谱法（planarchronatography）：在平面介质上进行组分分离的色谱法，也叫平板色谱法。,第四部分HPLC的组成、工作原理、应用,1高效液相色谱仪组成、工作原理高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。,2高效液相色谱仪的应用高效液相色谱法只要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。与试样预处理技术相配合,HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度,使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展,有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。,HPLC成为解决生化分析问题最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用,流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。液相色谱-质谱连用技术受到普遍重视,如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等;液相色谱-红外光谱连用也发展很快,如在环境污染分析测定水中的烃类,海水中的不挥发烃类,使环境污染分析得到新的发展。,第四部分HPLC常见故障处理,故障1流动相内有气泡,关闭泵,打开泄压阀,打开purge键,清洗脱气,气泡不断从过滤器冒出,进入流动相,无论打开purge键几次,都无法清除不断产生的气泡。原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内,过滤器内部由于霉菌的生长繁殖,形成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器,空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。,处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,超声清洗几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中1236小时,轻轻震荡几次,再将过滤器用纯水清洗几次,打开泄压阀,打开purge键,清洗脱气,如仍有气泡不断从过滤器冒出,继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器中冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏,流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀,打开泵,流速调至1.03.0ml/min,纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀,纯甲醇冲洗半小时即可。,故障2柱压高原因(1)缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内;(2)样品污染沉积。处理对于第一种情况先用4050的纯水,低速正向冲洗柱子,待柱压逐渐下降后,相应提高流速冲洗,柱压大幅度下降后,用常温纯水冲洗,之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况,由样品的沉积引起污染的C18柱,和纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再用换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。,故障3既无压力指示,又无液体流过1。原因(1)泵密封垫圈磨损;(2)大量气泡进入泵体。处理对于第一种情况,更换密封垫圈;对于第二种情况,在泵作用的同时,用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。,故障4压力波动大,流量不稳定.原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量,保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗.,故障5出峰不佳,峰分叉。原因(1)色谱柱被污染;(2)柱头填料塌陷。处理对于第一种情况,先用纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况。,对于第二种情况,拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料),装入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧,再填平,滴甲醇,再压紧反复几次,直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净,擦净柱外壁的填料,拧紧柱头,用纯甲醇冲洗30分钟以上。,故障6峰面积重复性不佳。原因(1)进样阀漏液;(2)加样针不到位。处理对于第一种情况更换进样阀垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从