课题3　血红蛋白的提取和分离.ppt

课题3血红蛋白的提取和分离、主题5DNA和蛋白质技术、分离1 -生物高分子的基本想法是什么？ 选择一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物高分子。 2考虑蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、带电的性质和量、溶解度和吸附的性质以及对其他分子的亲和力等，可以用于分离不同的蛋白质。 3高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的什么样的作用，作用结果是考虑什么被破坏的变性、变性、空间结构，4人用鸡的红血球提取DNA，人的红血球提取血红蛋白的原因是什么考虑鸡的红血球具有核，含有DNA DNA提取容易，人红细胞无核，结构简单，血红蛋白含量丰富，血红蛋白提取容易。 一、基础知识：凝胶色谱法：1，凝胶：几个微小多孔球体(包括多个贯通通道，由多糖构成的葡萄糖、琼脂糖、多孔凝胶称为分子筛)，2，概念：根据分离的物质对蛋白质分子质量的大小，具有网状结构3、原理：不同的蛋白质通过凝胶后，()的蛋白质容易进入凝胶内部通道，行程()、移动速度()，另一方面，()的蛋白质难以进入凝胶内部通道，()移动、行程()、移动速度()，相对分子质量不同的蛋白质被分离出来。 4、具体过程，相对分子质量小、长、慢、相对分子质量大、凝胶外部、短、快、凝胶色谱分离蛋白质的原理，1、概念：在一定范围内，外来少量强酸、强碱或少量稀释溶液的PH值也不明显变化缓冲溶液：2，作用：抵抗溶液对()的影响，能使PH几乎保持一定。 外界的酸和碱、PH、3、缓冲溶液的调制，通常是将()种缓冲剂溶解在水中调制的。 调节缓冲剂的()可以制成()用的缓冲液。 1-2、使用比例，在不同的PH范围内，考虑说话人体血液中的缓冲液。NaH2PO4/Na2HPO4，H2CO3/NaHCO3，电泳：1，概念：带电粒子在电场中移动的过程。 血红蛋白实验室整体使用的缓冲液是磷酸缓冲液，利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，以保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和材料的科学研究(活性)，2，原理：很多重要的生物高分子，如()等在()下通过电场，这些带电分子向其()移动。 电泳利用分离的样品中的各种分子()和分子本身()、分子()的不同使带电分子产生不同()，实现了样品中的各种分子的分离。 多肽、核酸、可解离基团、正或负、带电相反电极、带电特性差异、大小、形状、移动速度、一定PH、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 测定()通常可以加入凝胶中，用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，测定蛋白质的相对分子质量，去除静电荷对迁移率的影响。 的双曲馀弦值。 由几个多肽链组成的蛋白质复合物被SDS分解成一个多肽链，因此测定结果只是() SDS形成各种蛋白质和蛋白质SDS复合体，SDS的负电荷量大大超过了蛋白质分子的原始电荷量。 因此，隐藏了不同蛋白质之间的电荷差异，完全依赖于电泳迁移率。 聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质的迁移率取决于其带电量和分子的大小等。 SDS，单链的分子量，分子的大小，电泳检查的结果，这是由两个-肽链和包含两个-肽链的四个多肽链组成的。 各肽链包围着血红素基，可以运送一分子的氧或一分子的二氧化碳。 血红蛋白因为含有血红素而变红。 二、实验操作、蛋白质的提取和分离一般分为四个阶段： (1)样品处理：血红蛋白稀释，包括清洗红血球； 通过离心等操作收集的血红蛋白溶液。 (2)粗分离：透析去除分子小的杂质。 (3)纯化：用凝胶色谱去除分子量大的杂质蛋白质。 (4)纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 二实验操作，蛋白质提取和分离一般有四步：1 .样品处理，血液、血浆、水分、固体物质、血浆蛋白质、无机磷脂葡萄糖等，血球、白血球、血小板、红血球(最多)、血红蛋白()，两个a肽链，两个肽链，样品处理-粗分离-。 加入柠檬酸钠防止血液凝固离心，将血液分层，用粘着剂吸管吸引黄色血浆的生理盐水洗涤。 2、血红蛋白释放：在蒸馏水和甲苯的作用下红血球破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分离层； 滤纸过滤除去脂溶性沉淀层； 分液漏斗分离红色的透明液体。 4、透析：放入透析袋，放入磷酸缓冲液(ph7.0)透析。 1 .清洗红血球，阅读思考：清洗的目的是什么清洗过程：血液100mL，上清用黄色，直到红血球的清洗消失为止，反复清洗3次，2 .在放出血红蛋白，放出血红蛋白的过程中，读取清洗后的红血球中含有什么物质的释放过程目的分析：蒸馏水的作用是 加入甲苯的作用就是： 充分搅拌的话，就能充分搅拌。 使红血球大量吸水破裂，溶解红血球细胞膜，加速红血球的破裂，3 .分离血红蛋白，分离过程，分离红血球混合液，血红蛋白溶液，有机溶剂无色透明的甲苯层，脂质物质白色脂溶性物质沉淀层，血红蛋白溶液红色透明液，红血球破碎物沉淀暗红色沉淀，二， 粗分离透析血红蛋白，(三)精制-凝胶色谱操作，1 .凝胶柱的制作：2 .凝胶柱的装填：3 .样品的添加和溶出：材料：交联葡聚糖凝胶G-75； 20mmol/L磷酸缓冲液填充： 2、2 .凝胶柱填充：立即用磷酸缓冲液清洗平衡12h，清洗平衡，一口气缓慢注入，轻轻敲打填充悬浊液，凝胶粒子洗脱液沸水浴、凝胶粒子蒸馏水充分膨胀，由柱体积计算凝胶使用量，将柱垂直固定在支架上，调制悬浊液计算固定柱，3 .样品的添加和溶出：(4)纯度鉴定：凝胶电泳，注意事项，1 .红血球的清洗：清洗次数不可过少； 低速短时间离心。 2 .凝胶预处理：沸水浴法时间短，也能去除微生物和气泡3 .柱装填：尽可能填塞，降低粒子间隙没有气泡的洗脱液不能断开。 4 .柱成功标志：红带均匀移动。练习牢固，1、随着人类进入蛋白质组学时代，蛋白质组学的研究和应用越来越深入，首先，a阐明了各蛋白质组学的空间结构，b阐明了各蛋白质组学的功能，c阐明了各蛋白质组学的合成过程d揭示了高纯度的蛋白质组学在用凝胶色谱分离蛋白质组学的过程中，蛋白质组学的记述准确地说， a的相对分子量小蛋白质的行程相对分子量大，蛋白质b的相对分子量小的蛋白质的行程相对分子量大的蛋白质c的相对分子量小的蛋白质的行程和相对分子量大的蛋白质d的行程完全无法比较，3， 在使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中不同