黄牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法 征求意见稿

ICS07.080A 40DB15内蒙古自治区地方标准DB 15/ XXXXXXXXX黄牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法Real-time PCR method for authentification of cow and horse-derived materials 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施发布DBXX/ XXXXX前言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。本标准由锡林郭勒职业学院和锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心提出。本标准由内蒙古自治区肉乳标准化委员会归口。本标准起草单位：锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心。本标准主要起草人： 郭梁、罗建兴、徐伟良、郭元晟、李春冬、刘国强。6黄牛和马源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法1 范围本标准规定了肉乳制品中黄牛和马源性成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于鲜肉、鲜乳、发酵乳、加工肉制品、加工乳制品中黄牛和马源性成分的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 15481 检测和校准实验室能力的通用要求GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1实时荧光PCR real time PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。3.2Ct值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 原理利用不同荧光集团标记特异性黄牛和马探针以及质控探针，采用多重实时荧光PCR技术，对提取于鲜肉、鲜乳、发酵乳、加工肉制品、加工乳制品的DNA进行扩增。在同一反应中对黄牛和马特异基因以及质控基因同时扩增，三种荧光同时检测。其中，同管质控探针的检测旨在监控扩增反应是否正常进行，杜绝假阴性结果。通过评价相应荧光的扩增曲线以及Ct值判断肉乳制品是否含有黄牛和马源性成分。5 试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水。5.1 DNA提取试剂5.1.1 CTAB提取液：10 g CTAB，40.6 g NaCl，6.06 g Tris-HCl，3.94 g Na2EDTA，先加入800 mL的蒸馏水，在65水浴加热溶解，用HCl调节pH至8.0，加蒸馏水定容至1000 mL，高压灭菌，使用前加入终浓度为2%的-巯基乙醇。5.1.2 三氯甲烷。5.1.3 异戊醇。5.1.4 异丙醇。5.1.5 75%乙醇。5.1.6 乳化剂：20 mL Triton-X100（90%），125 mL乙醇（95%），855 mL NaCl（0.9 g/L），加蒸馏水定容至1000 mL，高压灭菌。5.1.7 PBS缓冲液（磷酸缓冲液）：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，先加入800 mL的蒸馏水溶解，用HCl调节pH至7.4，加蒸馏水定容至1000 mL，高压灭菌。5.2 实时荧光PCR试剂5.2.1 TaqMan实时荧光PCR反应试剂盒。5.2.2 引物和探针黄牛和马源性成分扩增引物和探针、质控探针详见表1。表1 引物和探针序列名称序列（5-3）目标基因/大小正向引物TTGAATYAGGCCATGAAGC线粒体12S rRNA基因黄牛120 bp马121 bp反向引物CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC黄牛特异性探针FAM-CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG-TAMRA马特异性探针HEX-TTCATATGTTTGGGTCACGGTTTTATGT-TAMRA质控探针ROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-BHQ-2用水分别将上述引物和探针稀释到10 mmol/L，探针需避光保存，序列中Y代表T/C。5.2.3 阳性对照用已知含有黄牛和马源性成分的样品作阳性对照。6 仪器6.1 实时荧光PCR仪。6.2 离心机：离心力12 000 g。6.3 核酸蛋白测定仪或紫外分光光度计。6.4 微量移液器：0.5 mL10 mL，10 mL 100 mL，20 mL 200 mL，100 mL 1 000 mL。6.5 实时荧光PCR反应管。6.6 重蒸馏水发生器或纯水仪。6.7 金属浴或恒温水浴锅。6.8 pH计：0.01级。6.9 均质器或搅拌机。6.10 分析天平：感量0.1 g和0.1 mg。7 分析步骤7.1 试样制备利用均质器将固态样品充分均质，充分混匀，装入清洁容器中，加封后，注明标记。利用搅拌机将液态样品充分均质，充分混匀，装入清洁容器中，加封后，注明标记。试样于-20冷冻保存。7.2 DNA提取7.2.1 鲜肉及肉乳制品样品（固态）取100 mg均质固态样品于1.5 mL灭菌离心管中；加入CTAB提取液，混匀，65水浴30 min，期间每隔5 min颠倒混匀一次。13 000 rpm离心5 min，转移上清于洁净离心管中，加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24/1）混合液，充分混匀，13 000 rpm离心5 min，取上清于新的离心管中加入等体积的异丙醇，充分混匀，13 000 rpm离心 5 min，弃去上清，75%乙醇洗涤一次（瞬时离心去上清），室温晾干，加入适量的灭菌重蒸水溶解，按照7.2.3测定其浓度。保存于-20。7.2.2 鲜乳及乳制品样品（液态）取50 mL均质液态样品于50 mL灭菌离心管中；7 500 rpm离心30 min（4），用小勺刮去离心管上层的乳脂，用吸管将中间层的乳蛋白去掉，留下最底部的沉淀；向离心管底部加入600 mL PBS，将底部沉淀悬浮并转移至1.5 mL的离心管中，12 000 rpm离心10 min（4），弃去上层液体，保留底部沉淀；向底部沉淀加60 mL乳化剂和540 mL PBS，振荡至沉淀完全悬浮，40恒温水浴处理10 min，12 000 rpm离心10 min（4），弃上清保留底部沉淀；加500 mL PBS悬浮沉淀，12 000 rpm离心10 min，保留底部沉淀；取100 mg沉淀细胞加入1.5 mL灭菌离心管中，加入CTAB提取液，混匀，65水浴30 min，期间每隔5 min颠倒混匀一次，13 000 rpm离心5 min，转移上清于离心管中，加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24/1）混合液，充分混匀，13 000 rpm离心5 min，取上清于新的离心管中加入等体积的异丙醇，充分混匀，13 000 rpm离心5 min，弃去上清，75%乙醇洗涤一次（瞬时离心去上清），室温晾干，加入适量的灭菌重蒸水溶解，按照7.2.3测定其浓度。保存于-20。7.2.3 DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值A260和A280。当A260/A280比值在1.72.2之间时，适宜于实时荧光PCR反应。7.3 实时荧光PCR检测7.3.1 实时荧光PCR反应体系设置阳性对照（含有黄牛和马源性成分DNA），阴性对照（非黄牛和马源性成分DNA），空白对照（反应空白对照以及提取空白对照）。所有样品设置两个平行。实时荧光PCR反应体系如表2。表2 实时荧光PCR反应体系试剂体积 mL实时荧光PCR反应混合液正向引物（10 mmol/L）1.0 反向引物（10 mmol/L）1.0 黄牛特异性探针（10 mmol/L）0.5 马特异性探针（10 mmol/L）0.5 质控探针（10 mmol/L）0.5 DNA模板（10100 ng/mL）1.0 灭菌重蒸水总体积20.0 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“”表示体积不确定。根据TaqMan反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到20.0 mL。7.3.2 实时荧光PCR反应程序预变性：94 30 s，1个循环；94 5 s，60 31 s，40个循环，在每次循环的退火时收集荧光。8 质量控制8.1 空白对照：所有探针无荧光对数增长或Ct值40.0。8.2 阴性对照：特异性探针无荧光对数增长或Ct值40.0；质控探针有荧光对数增长，Ct值30.0。8.3 阳性对照：特异性探针和质控探针都有荧光对数增长，且出现典型的扩增曲线，Ct值30.0。9 结果分析与表述9.1 结果判定在符合第6章的情况下：a) 特异性探针Ct值35.0且质控探针Ct值35.0，则判定为阳性。b) 特异性探针Ct值40.0且质控探针Ct值35.0，则判定为阴性。c) 特异性探针35.0Ct值40.0且质控探针Ct值35.0，则需要重复实验，如再次扩增后特异性探针Ct值仍40.0，则判定待检样品为阳性；如再次扩增后特异性探针Ct值40.0，则判定待检样品为阴性。d) 平行样品结果不一致，需要重新扩增。9.2 结果表述9.2.1 样品阳性，表述为“检出黄牛或/和马源性成分”。 9.2.2 样品阴性，表述为“未检出黄牛或/和马源性成分”。10 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403中附录D的规定执行。附录A （资料性附录）A.1 黄牛特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列（120 bp）及引物和探针位置TTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACGCACTAGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAG注：下划线部分为正向引物和反向引物序列，双下划线部分为质控探针序列，波浪线部分为黄牛特异性探