组织切片技术.pptVIP

石蜡切片和H(3)取出载玻片，用自来水冲洗10分钟，彻底冲洗泡沫(弹簧夹戴上后，单片通过水)；(4)将载玻片从水中取出，用蒸馏水冲洗三次(最好让水在单片上通过)；(5)将载玻片浸泡在95%乙醇(分析纯)中；(6)取出载玻片，在切片盒中编码，自然干燥(或在中高温无风下干燥)备用；注意：因为盖玻片很薄，所以不能和载玻片一起操作。将盖玻片从95%乙醇溶液中取出，放在吸水纸上展开。干燥后，放在一个小盒子里备用。(2)切片粘合剂类型聚赖氨酸(分子量300 KD): 0.5%浓度。APES试剂(3-氨基，丙基三氧基硅烷):清洁载玻片丙酮5min apex (1 ml 50ml丙酮):用镊子夹住APES试剂，浸泡1 3次纯丙酮洗涤2次干燥载玻片铝箔包裹，室温或4保存备用。铬明矾明胶溶液：铬明矾0.5g明胶5gH2O1000ml蛋清甘油：新鲜鸡蛋，先用剪刀或千分针在鸡蛋的顶端打一个小孔，然后在鸡蛋的另一端打一个小孔，稍微放大，使大孔的一端朝下，使蛋清流入100-200ml的烧杯(无蛋黄)，用玻璃棒敲打蛋清，使蛋清完全变成雪花状泡沫。 然后倒入装有多层纱布的漏斗中过滤，得到透明、凉爽的蛋白溶液，然后加入等量的甘油，摇匀使其充分混合，并加入1%的麝香草酚或樟脑以防止腐蚀。 一般来说，它被放入滴瓶或口香糖瓶中以备后用，当不使用时，它被很好地覆盖以防止灰尘。切片要求和注意事项：(1)切片刀要快，切片厚度要在5 10 m之间。(2)切片顺序贴在载玻片的下1/3处。(3)在52-60下烘烤切片。(4)第1节。(5)可在4保存数年(石蜡切片)(6)冷冻切片冷却干燥后应立即固定(7)冷冻切片应分为固定组织和新鲜组织，固定组织用普通糖处理24小时后应为冷冻切片。2.7、染色按来源分(l)天然着色剂这种着色剂是从动植物中提取的，是天然产物，产量低。目前，苏木精、品红、地衣红和靛蓝是常用的。其中，苏木精和品红是最常用的。(2)合成着色剂全部由芳香环或具有芳香性质的杂环化合物组成。它最初是由煤焦油的蒸馏产物合成的，因此也被称为煤焦油染料。除了上述两种类型外，一些无机化合物如硝酸银、氯化金和锇酸也用于生物染色。2.7.1染色剂的分类，根据其用途：(1)核染色剂是天然染色剂苏木精和品红，以及合成染色剂番红、结紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、亚甲蓝、孔雀石绿和焦油紫。(2)细胞质中使用的细胞质染色剂包括曙红、亮绿、橙G、酸性品红、苦味酸、水溶性苯胺蓝等。(3)用于显示脂质的脂质染色剂包括合成染色剂中的苏丹三号、苏丹四号、尼罗蓝硫酸盐和油红。根据染色剂的化学性质，可分为碱性染色剂、酸性染色剂和中性染色剂。碱性、酸性和中性着色剂是由酸和碱组成的盐。碱性染色剂和酸性染色剂的主要区别在于染色剂的主要着色部分是阳离子还是阴离子。如果染料被电离，其分子的主要部分变成阳离子，成为碱性染料；如果电离，其分子的主要部分是阴离子，这是酸性染料。该理论认为，组织细胞的染色主要依赖于以下三种物理作用中的一种或全部，以使染色剂进入组织或细胞。(1)毛细作用和渗透作用，但染色剂和组织细胞没有牢固的结合(2)吸收也称为溶解理论。这个理论认为组织细胞能够被染色的主要原因是吸收。组织吸收污渍并牢固结合。组织的颜色与溶液的颜色相同。2.7.2染色原理，(3)吸附吸附吸附是固体物质的特征，即较大的物体可以从周围吸附一些小颗粒(化合物或离子)细胞中的各种蛋白质或胶体具有不同的吸附表面，因此它们可以选择性地吸附不同的离子，即某一种蛋白质对某一种染色剂有吸附作用，而对其他染色剂没有吸附作用，这可以解释差异染色现象。染色化学作用的主要理论基础是，着色剂的性质可分为酸性、碱性和中性着色剂，而动物和植物的细胞内成分通常也可分为酸性(阴离子)和碱性(阳离子)部分。当碱性染料溶液中的有色部分变成阳离子时，它可以更牢固地与细胞的阴离子(酸性部分)结合，而当酸性染料溶液中的有色部分变成阴离子时，它可以更牢固地与细胞中的阳离子(碱性部分)结合。例如，细胞核，尤其是细胞核中的染色质，主要由核酸组成，并且是酸性成分。因此，它与碱性染料(苏木精)有很强的亲和力，易于着色。细胞质含有碱性物质，因此它与酸性染料(曙红)有很大的亲和力，并且容易着色。组织切片最常用的染色方法是he染色、苏木精-伊红对比染色(简称HE染色)的基本技术。该方法适用范围广，可对组织细胞的各种成分进行着色，便于全面观察组织结构，适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色，可长期保存。HE染色后，细胞核被苏木精染成蓝紫色，细胞质被曙红染色染成粉红色。石蜡切片脱蜡成水。染色前需要脱蜡，因为染料是水溶性的。冷冻切片从-80取出，晾干或用电吹风吹干后直接染色。石蜡切片脱蜡步骤如下：二甲苯10分钟，二甲苯37分钟，无水乙醇37分钟，无水乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，85%乙醇2分钟，75%乙醇2分钟，水洗。染色):染料可以在微结构上显示不同的颜色，便于观察和鉴定。苏木精和曙红染色(简称he染色)苏木精的染色方法是紫蓝色和碱性染料，可使细胞核和细胞质中的嗜碱性物质(RER、游离核糖体)呈蓝紫色。曙红：红色、酸性染料，可制造大多数细胞器，如细胞质基质和溶酶体，以及细胞基质中的胶原纤维等。红色。普通染色、染色法、HE染色、苏木精、曙红、嗜碱性结构：细胞核粗面内质网游离核糖体、嗜酸性结构：细胞质基质溶酶体、线粒体和其他细胞器胶原纤维等。染色后，重新加入酒精和二甲苯，最后用中性胶密封，长期保存。*第：节固定梯度酒精向上二甲苯石蜡。*染色：石蜡二甲苯梯度降醇水。*节约：水梯度酒精二甲苯中性树胶。(1)步骤1。脱蜡二甲苯I10分钟二甲苯II5分钟2。水合100%酒精I5分钟100%酒精II5分钟95%酒精I5分钟95%酒精II5分钟85%酒精3分钟75%酒精2分钟蒸馏水冲洗1分钟。3.染色苏木精染色5分钟自来水洗涤盐酸酒精鉴别15秒自来水洗涤(显微镜检查)自来水洗涤15分钟蒸馏水洗涤2分钟75%酒精2分钟85%酒精2分钟0.5%曙红染色1分钟95%酒精I5分钟95%酒精II5分钟100%酒精I5分钟100%酒精II5分钟二甲苯I5分钟二甲苯II5分钟4。胶囊胶胶囊片剂，(2)注意事项1。一定要了解所用染液的配制方法以及不同染液染色后的染色结果2。染色过程中使用的时间应根据染色时的室内温度、染液的新鲜度和实验室的实际情况灵活控制。如果室温高，切片和染色液是新配制的，染色时间会短，否则时间会长。3.艾琳是水溶性和醇溶性的。如果是水溶性的，应该在脱水前染色。如果它是溶于酒精的，应该用与溶解的艾琳浓度相同的酒精开始脱水。4.二甲苯脱蜡前，可将切片放入60烘箱中0.51小时，使切片粘附更牢固，不易脱片，也有利于脱蜡。5.二甲苯在HE染色中具有脱蜡和透明作用。二甲苯脱蜡的质量主要取决于切片在二甲苯中的放置时间、脱蜡过程中的温度和二甲苯的使用次数。染色的切片必须是透明的，这有利于微观观察，也是密封切片的桥梁。6.使用梯度酒精脱水时，在低浓度酒精中的时间不宜过长，达到高浓度时应逐渐延长脱水时间。为了避免不完全脱水而影响二甲苯的透明度。7.不要在酸性分化液中停留太久，也不要过度分化，以免使细胞核内的染色结构脱色。对于不需要分化处理的苏木精染色，应注意掌握染色时间，防止组织切片染色背景过深或细胞核、细胞质染色不充分。最常见的染料是苏木精(H)和曙红(E)。*苏木精是一种碱性染料，蓝紫色，可使细胞核等着色。被苏木精染色的结构本身是酸性和嗜碱性的。*曙红是一种酸性染料，粉红色。大多数细胞的细胞质可以染成红色。被曙红染色的结构是碱性和嗜酸的。*不容易被苏木精和曙红染色的结构具有嗜中性粒细胞。石蜡切片HE染色，其他染色方法：硝酸银神经细胞(黑色)，醛变红弹性纤维(紫色)，甲苯胺蓝肥大细胞(紫色)，PAS染色：糖分子高碘酸盐乙二醛+希夫试剂紫红色，苏木精4g无水乙醇25ml10%铵明矾(硫酸铝铵)水溶液400m1。制备时，先将苏木精溶于无水乙醇中，完全溶解后，加入10%的明矾水溶液，充分搅拌混合后，注入细口瓶中，用纱布封住瓶口。然后将瓶子放在温暖明亮的地方3-4天，过滤，然后加入100毫升甘油和100毫升甲醇，混合均匀后，仍然用纱布封住瓶口，然后放在有足够光线的地方1-2个月成熟。当颜色变成紫棕色时成熟。成熟后，过滤，塞住瓶口，储存在阴凉的地方。它可以储存很长时间而不会损坏很多年。这种液体有很强的着色力，可以染色几分钟。也可将l份染液用3-5份蒸馏水稀释后使用，染色时间需延长1-数小时。该液对细胞核和嗜碱颗粒的染色效果良好。用植物细胞染色的纤维壁比任何其他染色溶液都好。附件2:染色剂和染液的配制，步骤如下：二甲苯二甲苯1/2二甲苯1/2乙醇混合液100%乙醇95%乙醇85%乙醇70%乙醇苏木精染液0.01%盐酸自来水70%乙醇85%乙醇曙红染液95%乙醇100%乙醇1/2二甲苯1/2乙醇混合液二甲苯二甲苯密封。石蜡切片常见问题及处理，无切片的常见原因：切片刀不够锋利。(2)切片刀与蜡块之间的角度不合适。(3)蜡块周围留下的蜡边太少。石蜡硬度过高，粘度不足。解决方法：重新磨刀。调整切片刀的角度。(3)可将嵌蜡块再次或四周熔化，然后将人放入嵌蜡框中去填蜡，石蜡在组织块周围修补时将蜡块涂至2mm为宜。(4)如果蜡块太硬，可加入一些蜂蜡或用熔点较低的石蜡重新包埋。将蜡块放入冰箱延长冷冻时间，然后快速切片。切片弯曲的常见原因是：组织成分和形状不规则。(2)蜡块上下或左右不平行。(3)蜡块与切割刀的刀口不平行。(4)切片刀的锋利度处处不一致。解决方法：修剪组织块时，注意修剪整齐，切成正方形或长方形，尽量不要切成三角形。(2)反复展平并对称蜡块的四边。调整蜡块支架，使其与切片刀平行。移动切片刀，改变刀口位置。(5)用负离子发生器直接吹切片，防止切片卷曲，切片裂纹的常见原因如下：(1)切片上有一个小间隙解决方法：切片刀上有一个缺口，可以更换或重新磨尖。刀刃上的间隙太大且不均匀。你可以在磨刀石上垂直地磨几次刀刃，然后用传统的方法磨。(2)擦拭刀口。(3)适当减少脱水、透明度和浸蜡时间。(4)组织中太多的硬物质不适合使用。贴膜的水温应在45左右。包埋时，蜡块周围应凝结一层蜡，然后放入冷水中。切片厚度不均的常见原因：脱水、透明、蜡浸过多、时间长、温度高。(2)蜡块太大太硬，转动时叶片振动。(3)芯片微部分失效，齿轮跳动。解决方法：调整脱水、透明度、浸蜡时间和温度。(2)如果蜡块过大，注意今后材料的尺寸。蜡块组织良好，可以放回水中浸泡，然后脱水并再次掩埋。(3)修理切片机的破损部分，调整螺钉，用机油润滑零件，必要时请专业技术人员调整切片机。切片起皱的常见原因：石蜡太软或室温太高。(2)切片刀上粘有残留石蜡，刀口不干净。(3)组织蜡浸泡时间不够，或脱水、透明度不够。(4)切片刀不锋利。贴膜温度过高或过低。解决方法：蜡块可以在冰箱里冷冻切片，用冰冷冻或切片时变成蜡。如果室温太高，打开空调降低室温。(2)切片刀不干净，可用少量二甲苯将沾有棉花的边缘擦拭干净。(3)重复浸蜡过程或延长脱水和透明时间。(4)磨快切片刀，再次切片。安装板的水温应为45。先将薄纸蜡带放入35%漂白酒精中，然后取出放入温水中防止起皱。将刀粘在切片上的常见原因是：切片过程中会产生静电作用，从而产生静电吸引，这种现象通常发生在冬季或干燥气候下。解决方法：加湿器可以用来增加空气中的水分，减少静电效应。(2)用冷水浸湿卫生纸，并包围切片机控制台，以在切片机控制台周围形成静电屏蔽。(3)用胶片冲洗过程中使用的画笔清洁湿纸上的蜡屑。切片脱落的常见原因是：太厚的材料或含有过多血液和脂肪的组织。(2)组织固定不良、脱水不完全和透明性阻止石蜡进入组织。(3)组织过度脱水和透明，蜡浸泡时间过长或温度过高都会导致组织收缩变硬变脆。(4)载玻片不干净。用紧急水冲洗或振动过猛。染液或试剂的酸碱度不合适或停留时间长。烘烤时间过短，温度过低或时间过长，温度过高。石蜡和二甲苯使用时间过长。解决方法：材料不应太厚，右手鱼际肌应在载玻片的下2/3处均匀涂上蛋白甘油，厚度适中。(2)根据组织的大小和厚度，选择固定、脱水和透明的时间。或者在不影响诊断的情况下对组织进行再脱水，并将组织浸泡在透明蜡中。包埋蜡的熔点比浸泡蜡高3 5qc。(3)先用温水湿润，然后用冰硬化，然后切片。彻底清洁载玻片，使其呈中性。切片不能直接在水流下清洗或浸泡。同时，水的沸腾、再净化和蒸馏可以增加蜡片和载玻片之间的吸引力。冷开水作为浮板用水既方便又经济。染液或试剂的酸碱度合适，停留时间合理。通常在60下保温2小时。浸蜡两次，更换二甲苯。所谓灰色染色现象的常见原因有：固定液浓度过低或组织固定不及时、不彻底。(2)材料太厚。(3)水洗不够。脱蜡不足。解决方法：及时彻底地修复。原染色被去除并测试解决方法：在备用甲醛中加入适量的大理石或白粉笔作为中和剂，或经常更换脱蜡剂。(2)苏木精染色使组织呈暗紫色，可延长分化和发蓝时间；伊拉克红的