【基金标书】2010CB912200-基因组稳定性和细胞周期调控相关蛋白质群的功能及作用机制研究

项目名称： 基因组稳定性和细胞周期调控相关蛋白质群的功能及作用机制研究 首席科学家： 尹玉新 北京大学 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 教育部 一、研究内容 （ 一）拟解决的关键科学问题 面对我国生命和健康科学的重大需求和癌症等重大疾病研究的挑战，结合我们前期的研究基础，本项目将围绕遗传物质稳定性这一中心课题，选择细胞周期调节的各个环节，从蛋白质群入手解决如下关键科学问题： 1. 蛋白质群在 细胞生长分裂过程中细胞周期各个阶段的调控机制和相互作用。相关的信号传导通路在 细胞增殖过程中如何维持遗传物质的稳定性。 细胞异常增殖过程中相关蛋白质群的变化规律及其对细胞周期和基因组稳定性的影响。 2. 癌基因 细胞增殖和凋亡的分子调控机制， 其中发挥的作用。 （ 二）主要研究内容 1. 研究真核细胞 定 相互作用蛋白及阐明它们的生化功能；大规模确定新的明 定的机理以及 示检验点在维持遗传物质稳定性中的作用；从 S 期细胞中鉴定新的受 挑选适当的功能基因或蛋白，在细胞水平和整体水平（动物模型）分析、验证，且探讨其机制及意义。 2. 检测有丝分裂期间 定更多检测 用；通过基因敲除小鼠模型和转基因小鼠模型评价有丝分裂破坏与肿瘤发生的关系；深入探讨 网络。 3. 以癌症和衰老模型为主要研究对象，对前期已鉴定出的，与癌症发生或转移及衰老密切相关蛋白进行生物学功能及蛋白质糖基化修饰研究，探究其相互作用和信号转导途径，从蛋白质水平上揭示肿瘤或衰老细胞增殖异常的分子机制。研究调控细胞周期 期的新蛋白 过对其所调节蛋白质群的相互作用研究，揭示其调控细胞周期和肿瘤侵袭性生长的分子机制。 4. 筛选 路上游调节蛋白及下游靶基因，探索该通路已知蛋白之间的动态互作及通路激活机制，检测 而影响基因组稳 定性的分子机制；探索 微管结合蛋白之间的关系， 解析上述各蛋白协同或独立调控细胞增殖与凋亡、影响基因组稳定性的分子机理。 二、预期目标 （一）总体目标 瞄准国家战略需求和国际肿瘤相关科学研究前沿，从与遗传物质稳定性相关蛋白质群这一关键科学问题出发，在细胞周期的各个环节探讨相关蛋白质群的分子调控机制以及相互作用网络。在此基础上，鉴定一批新的与细胞正常、异常增殖调控相关的蛋白质群，建立全细胞水平的细胞周期相关蛋白质数据库；确定一些与维持遗传物质稳定 性相关的关键蛋白质群的结构、功能、相互作用和一些重要靶蛋白的动态调控机制，并研究它们的信号调控网络。此外，还将探索一些与细胞周期失调后决定细胞命运的信号通路调控细胞增殖和凋亡的分子机制。通过本课题的实施将使我国在细胞周期调控相关蛋白研究的相关领域达到或领先国际水平。同时，以本项目的实施为契机 , 促进蛋白质组学、生物学、医学、生物信息学等多学科研究的衔接和集成，培养一批交叉学科新型研究队伍。 （二）五年目标 1. 确定 规模确定新的 阐明 示检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。鉴定 期细胞中新的受 2. 评价 定更多与有丝分裂调控相关的蛋白质群。揭示抑癌基因 临床诊断和化疗提供理论基础。 3. 揭示蛋白质群在肿瘤发生和转移及衰老中的生物学功能，着重研究调控细胞周期的新蛋白 过对其所调节的蛋白质群的研究，揭示其调控细胞周期的分子机制。通过稳定同位素标记建立细胞核蛋白质动态表达分析鉴定的实验方法，并由此获得新的标志蛋白；针对所发现的新的相互作用蛋白，验证其与靶蛋白的相互关系并确定其生物功能并鉴定出关键核蛋白质修饰类型与可用于新药开发的重要靶标，并探讨其在肿瘤治疗、延缓衰老和保护细胞方面应用的可能性。 4. 阐明 定新的靶蛋白及其在定 示 心分子对基因组稳定性的调控机制； 分析 探讨 管结合蛋白质群 的关系及其 在调控细胞分裂和诱发凋亡中的作用 。 5. 取得具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高水平论文 50篇以上。其中，在影响因子大于 10的刊物发表 15养一批从事肿瘤基础研究和转化医学的交叉学科人才。 三、研究方案 （一）总体研究思路、技术路线及可行性分析 1. 总体研究思路 在细胞增殖过程中遗传物质的稳定性有赖于细胞周期的系统调节， 复制和 白质群在此过程中的相互作用使细胞周期的精密调控成为可能。 机体通过细胞周期调控维持基因组稳定性，这一过程是经由细胞周期的各个环节实现的。细胞周期分为 S、 期，研究细胞周期的调控应该分解到细胞周期自然过程的各个环节中。细胞周期调控的正常进行以及遗传物质的稳定性与肿瘤的发生以及衰老等生命重大事件密切相关。因此，鉴定参与调控细胞周期各个环节的蛋白质群并且评价这些蛋白质群在调控细胞周期的各个阶段、维持基因组稳定性中所发挥的作用机制以及蛋白质群之间的相互作用对于癌症等重大疾病研究 至关重要。对我们认识与了解这些疾病发生的机理，有效防治这些疾病具有重大意义。 基于以上思路，本课题重点围绕细胞周期的各个环节相关蛋白质群开展研究，阐明这些蛋白质群在细胞周期各个时期： 成、有丝分裂期的调控机制。评价蛋白质群对于细胞周期调控正常进行，维持遗传物质稳定性中的作用。在此基础上，我们将利用一个大型高通量蛋白质分析平台，大规模鉴定和分析与细胞周期调控和维持基因组稳定性相关的蛋白质群， 探究其相互作用蛋白和信号转导途径。 此外，我们还将研究多细胞生物如何处理细胞周期失调而发生遗传物质不稳定的情况 下而对细胞命运进行调节，探讨细胞生存、死亡与遗传物质稳定性的综合关系，即在细胞周期失调、基因组不稳定的情况下通过何种机制调控细胞命运，对细胞生存和死亡进行决断。这将不仅阐释机体清除癌细胞的机制，还将为癌症治疗提供更多的靶向药物选择。 细胞生长和 制相 关 蛋白 质 群课题 1有 丝分裂 和 复相 关 蛋白 质 群课题 2细胞 异 常增殖相 关 蛋白 质 群课题 3调节 细胞 增殖 和凋亡蛋白 质 群课题 4细胞生长和 复 制相 关 蛋白 质 群课题细胞生长和 复 制相 关 蛋白 质 群课题课题有 丝分裂 和 修 复相 关 蛋白 质 群课题有 丝分裂 和 修 复相 关 蛋白 质 群课题课题细胞 异 常增殖相 关 蛋白 质 群课题细胞 异 常增殖相 关 蛋白 质 群课题课题调节 细胞 增殖 和凋亡蛋白 质 群课题调节 细胞 增殖 和凋亡蛋白 质 群课题课题附图：主要技术途径流程图 2. 技术路线 根据我们的学术思路，本项目的总体研究技术途径如附图所示。研究细胞周期的各个时期相关蛋白质群的结构、功能、调控机制和相互作用，并且阐述细胞正常增殖过程中遗传物质稳定性的维持。还将研 究细胞异常增殖中蛋白质群的变化和细胞凋亡的程序控制。主要途径为：【课题一】 用遗传的方法筛选 接从细胞内分离 蛋白亲和层析的方法分离 用生化，遗传及荧光单分子技术阐明一些已知及一些新确定的 明 基因干扰技术（ 示该通路相关的检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。采用基因表达谱芯片或蛋白组学的方法，与课题二和课题三合作，筛选受 定 期细胞中新的受 课题二】确定 用基因芯片技术鉴定出新的 采用染色质 法确定 用蛋白质 通过传统的蛋白 质 定向诱变、荧光素酶 分析等方法 检测 用，利用课题组三的蛋白质分析平台鉴定 过建立小鼠动物模型从活体角度综合评价 持遗传物质稳定性的重要性。最后利用这一动物模型揭示抑癌基因 课题三】 以癌症和衰老模型为主要研究对象， 探讨在细胞异常增殖过程中相关蛋白质 群，如 变化规律。通过对目的基因进行表达干预（过表达或沉默），从体外到体内深入研究候选蛋白质群对细胞增殖、细胞周期调控的影响。结合信号通路的特异性抑制药物等分析目的基因表达干预后导致的新差异蛋白及所涉及的信号通路。采用 用稳定同位素标记并结合高灵敏度的生物质谱鉴定技术，研究细胞核蛋白质和 饰位点，阐明其信号转导机制及其在衰老过程中的功能。 采用 在体鉴定快速肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的实验系统，提高甄 别在细胞周期中调控异常增殖蛋白质群的效率。选择调控细胞异常增殖的代表性新蛋白，建立其与肿瘤病人的相关性。【课题四】研究 示 析 全基因组水平上通过干扰基因的表达（ 选 结合微阵列分析鉴定 过上位分析（ 过质谱分析鉴定蛋白修饰，特别是磷酸化修饰调控 统分析 析 胞增殖以及基因组稳定性之间的关系；通过蛋白共定位研究探讨 而探讨多细胞生物在细胞周期失调而发生遗传物质不稳定的情况下如何对细胞命运进行调节 。各课题组还将充分利用课题组三具备的大型蛋白质鉴定分析技术平台对 更多参与维持基因组稳定性的蛋白质群进行大 规模鉴定和分析。 3. 可行性分析 (1) 本项目的科研队伍以从事生物化学、分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生物信息学等国家和部门重点实验室、教育部 985创新平台为主体，集中了目前从事基因组稳定性和细胞周期调控相关蛋白质群研究的优势科研团队。其中，各课题负责人都是本领域的专家，亲自设计各自的课题并将指导项目的具体实施。 (2) 本项目着眼于大规模蛋白质组（群）而非单个蛋白的研究。 2007年 10月召开的国际蛋白质组学组织大会标志着从大规模技术性研究向差异和动态组学研究的趋势。但迄今已有的技术几乎都限于检测 和比较蛋白的累积量。课题三近期自主建立的 术对蛋白真正表达水平差异的测定提供了更敏感和更精密的手段，并且保持了高通量的能力。另一方面利用稳定同位素同时掺入细胞核蛋白质和 些新技术方法都是针对细胞调控中的蛋白质组（群）动态研究而开发的。本研究具备扎实的前期研究工作基础和创新技术平台，以及用于功能研究的基因敲除动物模型和高精确度的质谱分析鉴定蛋白质动态表达和蛋白质修饰平台。良好的工作基础和强大的蛋白质组学技术平台为本课题研究计划的顺利 进行提供了有力的保障。 (3) 参加本项目研究的各实验室具备优良的研究条件。同时，各课题间早已经形成了紧密的协作关系，各方面的研究相互交叉、组成了一个有机的整体。 课题二中建立的基因敲除小鼠模型以及转基因小鼠模型在国际上也具有领先地位，为其他课题顺利实施提供了珍贵的活体动物模型。课题三的高通量蛋白质鉴定和分析平台为其他各个课题组的研究分析提供了可靠、高效的技术平台。 （二）创新点 1. 本项目瞄准国际前沿，面向国家需求，综合利用多学科优势，集中针对遗传物质稳定性相关蛋白质群的分子调控网络和相互作用，展开多层 面更又互相关联的研究。 2. 本项目将细胞周期的各个时期有机地整合在一起，通过研究各个环节相关的蛋白质群及其调控和相互作用机理而探讨这些蛋白质群对细胞周期调控的分子机制，评价其作为有机整体和分子网络对遗传物质稳定性的相关性，在此基础上大规模鉴定和分析与细胞周期调控相关的各种蛋白质群，并探索这些蛋白质群之间的相互作用，构建与细胞周期调控和基因组稳定性维持相关的蛋白质组分子调控网络。此外，还进一步研究当细胞周期失调发生遗传物质不稳定后，多细胞生物作为有机整体利用何种机制对细胞命运进行决断，从而综合性评价细胞周期 调控与基因组稳定性的内在联系和相关蛋白质群的功能和相互作用。 3. 本项目 在研究内容方面具有完全创新性： 孔道春实验室在裂殖酵母 S. 们证明 铁邦教授在细胞周期和 现了一条新的调控通路（ 该通路在 1玉新课题组研究设想 这种调节在国际上也是全新发现。 张宏权课题组发现跨膜 受体整合素结合蛋白 丝分裂 中期（ 必须的，并证明这一作用是通过一个全新的 肖雪媛和纪建国课题组以肿瘤和衰老为实验模型，研究新发现的与细胞增殖异常相关蛋白的生物学功能及组蛋白修饰变化规律。而以此为基础构建靶蛋白表达干预后的交替多轮差异蛋白筛选策略。 4. 本项目在研究方法方面也具有独到之处，在国际上处于领先水平。 尹玉新课题组 在多年的研究基础上，发展了一系列体内、体外活体研究模型，例如小鼠基因敲除模型系统：他们已经成功敲除 且建立了一系列 过这些模型检测 究 这些作用可与特定小鼠模型的肿瘤发生直接关联，从而更加直观地评价 外，他们正在建立转基因小鼠模型预测某些重要蛋白过度表达是否可促进肿瘤发生。 张宏权课题组首次在斑马鱼 模型中建立了在 3 7天内在体鉴定肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的实验系统，为增殖异常的肿瘤细胞进行大规模体内评价提供了快速、经济和方便 的最新方法。 肖雪媛课题组则首次提出使稳定同位素同时掺入细胞核蛋白质和 而可以快速、定量鉴定表观遗传修饰的动态变化，这将有助于组蛋白修饰密码及其作用机制的确定。 （三）课题设置 课题一： 真核细胞 研究目标： 本课题将研究真核细胞 定 定人细胞的 规模确定新的 明 明 示检验点在维持遗传物质稳定性中的作用。阐明 示检验点在维持复制叉稳定的作用；鉴定 研究内容： 1. 确定 采用下面三种方法确定 是用遗传的方法筛选 是直接从细胞内分离 是用蛋白亲和层析的方法分离 2. 确定新的 在裂殖酵母 S. 果另一个复制蛋白由于突变使得它的活性降低，该蛋白就能拮抗 该方法已经筛选到了几百个突变株，现正确定它们的突变基因，并进一步与课题组三合作，利用高通量蛋白质鉴定分析平台研究新的 3 阐明 已发现 也发现 暗示 用生化和遗传的方法确定该蛋白，并最终阐明 4 鉴定新的 其机理和调控机制 本课题组最近发现，在 期的调控中也起重要作用。将用 基因表达谱芯片或蛋白组学的方法， 鉴定新的 受 挑选适当的功能基因或蛋白，在细胞水平和整体水平（动物模型）进行分析、验证，并探讨其作 用机制及意义。同时，本课题组还发现 而调控有丝分裂的过程 。本课题拟鉴定 被 讨 承担单位：中山大学、北京大学 课题负责人：康铁邦， 特聘教授， 42岁 , 中山大学肿瘤防治中心 学术骨干：孔道春、张丽君等 预算经费： 课题二： 研究目标： 本课题旨在探讨 首先了解 后研究 三建立活体动物模型以评价 后揭示 研究内容： 1. 检测有丝分裂期间 示着丝粒中 体外和体内的 丝粒 察 色体错排和分离错误，以及恢复着丝粒功能和关卡应答。 利用基因芯片技术鉴定出新的 采用染色质 法确定 2. 鉴定与 我们已建立了成熟的蛋白质 且成功地发掘出与有丝分裂相关的蛋白激酶，如 课题将利用这一成熟的系统通过标记 有丝分裂相关的蛋白质群。通过传统的蛋白质 定向诱变、荧光素酶 分析等方法 检测 用并且利用课题组三的蛋白质分析平台鉴定 3. 建立 评价 前期研究中已成功地建立了条件性 些 利用这些模型评价 丝分裂及其维持基 因组稳定性的作用，并且衡量基因组不稳定性与肿瘤发生的因果关系。 4. 揭示 课题组的前期研究结果显示： 失去 致自发性细胞死亡。我们将利用已建立的组织特异性 此评价抑癌基因之间的分子网络联系及对化疗药物敏感性的影响，为临床化疗、药物的筛选提供理论依据。 承担单位：北京大学、中山大学 课题负责人： 尹玉新，教授， 49岁 , 北京大学医学部基础医学院 学术骨干： 张辉等 预算经费： 课题三： 细胞增殖异常模型中的相关蛋白质群及其调控网络研究 研究目标： 本课题以肿瘤和衰老模型为主要研究对象，对前期已鉴定出的，与癌症发生或转移及衰老密切相关蛋白进行生物学功能的研究，鉴定新的参与细胞周期 期的蛋白并研究其在细胞异常增殖过程中的作用。从蛋白质群调控网络水平上揭示细胞增殖调控失常的分子机制。 研究内容： 1、对已初步选定的一些与异常增殖特异相关的关键蛋白， 如 和 用基因干扰技术和 课题二中所建立的转基因小鼠和 条件性基因敲除 等平台，从体外培养细胞到体内动物模型验证并研究其在肿瘤发生与转移以及衰老过程中的生物功能及其变化规律。 2、利用 选鉴定肿瘤或衰老相关蛋白的相互作用蛋白及其在干预靶蛋白情况下的动态变化规律。结合信号通路特异性抑制剂等手段探索和确定其所参与的信号转导通路，特别是与 路的关系。阐明其导致调控异常的分子机制。 3、利用前期研究所建立的体内快速检验异常增殖的与肿瘤相关的蛋白质群的斑马鱼 技 术平台 ，鉴定出调控肿瘤细胞异常增殖的重要蛋白质群，并在临床病人中建立相关性验证，以明确其在肿瘤诊断、预防和治疗中的意义，以及作为潜在药物靶标的可能性。 4、进一步改进和优化已初步建立的，可对组蛋白基因调控区的甲基化等修饰及修饰位点进行系统性定量鉴定的新技术，进而探索特殊修饰在细胞增殖调控异常中的作用。力求发现和鉴定个关键核蛋白质修饰类型及有可能用于新药开发的重要靶标。 承担单位：北京师范大学、北京大学 课题负责人：张宏权，教授， 46岁，北京大学 学术骨干：肖雪媛、纪建国等 预算经费： 课题四： 调控细胞增殖与细胞凋亡的分子机制研究 研究目标： 本课题将主要研究 析微 研究内容： 1、 过上位分析（ 过质谱分析鉴定 别是激酶 2、鉴定新的靶蛋白。利用已有的 过 定新的 通过上位分析（ 定其在 3、鉴定 课题组三合作，利用高通量蛋白质分析平台和已制备的 过小分子定新的 别是上游调控分子并分析其功能，分析通路的激活机制。 4、系统分析 速离心分离细胞组分，确定 胞质、细胞核以及细胞器的定位；在细胞整体水平上观察通路蛋白的定位与转位，分析引起蛋白转位的因素与意义； 可以调控中心体的复制与染色体的分离，从而影响基因组的稳定性。我们将与课题组二合作，探讨三者之间的相互关系，为 5、探索 析上述各蛋白协同或独立调控细胞增殖与凋亡的分子机理 。 承担单位：南开大学 课题负责人： 吴世安 ，教授， 40岁， 南开大学生命科学学院特聘教授 学术骨干：周军、朱玉山等 预算经费： （四）各课题间的相互关系，以及与项目总体目标和五年目标的关系 根据总体目标的要求，本项目的中心思想是维持细胞增殖与分裂过程中遗传物质的稳定性，而这一稳定性的维持有赖于细胞周期的精细调节，在此过程中不同蛋白组群相互作用、相互影响和相互调节。本课题组将根据这个原则进行分解、设计，了解与探索在细胞周期各个阶段蛋白质活动的规律 ，探索信息传导在细胞周期调节过程中的重要作用，评价细胞生存和死亡调控机制的价值。各个项目围绕细胞周期的不同阶段或不同检验点，选择特定的研究渠道进行机制研究和探索。各个课题之间相互联系、互相促进，旨在实现本项目的总体目标，即从与遗传物质稳定性相关蛋白质群这一关键科学问题出发，在细胞周期的各个环节探讨相关蛋白质群的分子调控机制以及相互作用网络。 本项目五年目标的完成则具体表现在以上所述四个课题的研究计划中：课题一、着重研究 时研究 作用 ；课题二、了解有丝分裂过程中 将进一步探讨 上两个课题主要探讨细胞正常生长分裂过程中的两个重要事件： 题三则利用现有的蛋白质分析技术平台来对细胞异常增殖中涉及的各种蛋白质群进行系统的大规模的鉴定和分析，以达到全面理解细胞周期调节中各个系统蛋白质相互作用的机制和形式。此外，细胞周期的完善与精细调节体现在遗传物质稳定性的保持。如果细胞周期不能进行正确调节，多细胞系统将通过信号传递及 细胞生长调控来实现细胞的存亡。课题四将研究不同细胞信号通路如何对细胞的生存和死亡进行精细调控。因而，以上四个课题相互关联，层次递进，从作为中心的遗传物质稳定性，到细胞周期各阶段的精确调节，到细胞周期失调导致细胞异常增殖，再到异常增殖导致的细胞信号通路的改变对细胞生物学功能的影响。这些从细胞周期衍生出来的变化，让细胞必须做出抉择：生或死；正常增殖或发生肿瘤。 课题组间在技术平台层面还存在广泛的联系和互助。课题一的高精度蛋白分离技术将会用于所有课题所面临的蛋白质纯化和分析的需求；课题二的基因敲除小鼠模型系统和课 题三的斑马鱼肿瘤转移模型系统可为其它课题组提供珍贵的活体动物模型，同时课题三建立的快速鉴定调控细胞异常增殖蛋白质群的动物在体技术平台，将大大加速对四个课题研究的与遗传物质稳定性相关蛋白质群的功能研究，并结合不同信号通路的在体研究，有助于快速揭示这些蛋白质群的作用机制；课题四的果蝇细胞快速增殖模型和转基因小鼠模型可用于测试各个课题组鉴定出的新的蛋白质群的功能。 四、年度计划 第一年： 研究内容 1. 筛选与 互作用的蛋白，并且大规模鉴定和 制有关的蛋白。 2. 建立稳定高表达 3. 确定 便最大限度地纯化出 4. 基因芯片法筛选出差异基因群，该基因群可能在转录水平直接或间接受 5. 着手研究 其意义。 6. 创建一系列 使其在结构上具有 这些 体转染 + 胞。对细胞周期中不同时期的细胞进行分析以获得 7. 在含有野生型 系中对动粒功能进行分析。 8. 建立 除 统和 导表达系统。通过 9. 通过基因表达干预等方法从体内外系统研究与肺癌发生和转移密切相关蛋白 10. 建立神经细胞衰老和衰老模型，制备不同发育或分化阶段的样品材料，进行亚细胞器分级实验，提取关键蛋白质组分。 11. 在 并在肿瘤病人标本上建立相关性。 12. 利用微阵列方法鉴定 13. 合成双链 建果蝇 14. 完成 路主要已知组成蛋白如 及微管结合蛋白蛋白 析上述蛋白的细胞内定位、共定位与转位情况。 15. 分析微管结合蛋白对细胞周期进程的影响，检测微管结合蛋白在肿瘤和对照组织中表达水平的变化及其表达对反映细胞生长或死亡的克隆形成率的影响，并通过 析微管结合蛋白表达对细胞增殖的 影响。 16. 制备并纯化 预期目标 1. 质谱确定和 互作用的候选蛋白。筛选得到一些和 互作用的蛋白。筛选得到 100个突变株。并开始突变株的形态分析、开始突变株突变基因的确定。 2. 分别得到 3株以上稳定高表达 3. 初步确定 4. 筛选出干扰 5. 确定 步确定 6. 揭示动粒中 7. 确定 集和集合障碍，动粒 8. 完成不同 定 9. 确认 或发展中的生物学作用。 10. 获得不同发育和衰老阶段的亚细胞器样品。 11. 选择 2 调的与肿瘤增殖和侵袭有关的转录因子，阐明其调控机制。 12. 得到 量表达后靶蛋白表达增加与减少的顺序列表，分析得到 3候选蛋白用于进一步分析。 13. 完成约 5， 000个果蝇基因双链 14. 获得 定位和转位情况，完成对 15. 获得微管结合蛋白对参与调控细胞增殖与凋亡机制的了解。 16. 得到 第二年： 研究内容 1. 用体外生化方法，验证和 手开展这些蛋白基因的突变株的筛选。开始筛选人细胞的 2. 对第一年筛选的突变株进行形态分析，确定突变株的突变基因。 列对比分析这些基因表达的蛋白及可能的功能域。 3. 体外验证和 互作用的蛋白。 研究 路的中间蛋白。着手开始筛选这些蛋白的突变株并开始功能分析。 4. 利用生物信息学找出其中与细胞周期、 5. 利用 用 6. 以 规模纯化 胞系与对照 胞系裂解蛋白， 及生物信息学鉴定出差异蛋白群。 7. 深入探讨 8. 将 过免疫荧光法和活细胞成像对上述细胞中的染色体排列和分离进行监测。 9. 采用 略从人类乳癌 胞中分离纯化在核内与 所得蛋白进行质谱分析后 搜索蛋白数据库进行鉴定。 10. 采用染色质免疫共沉淀法（ 测 动子 理上的关联。荧光素酶分析法检测 动子的转录调控。进行 指纹图谱分析，通过核心指纹图谱系统精确限定 动子的结合区域。在 动子区域构建一系列的缺失来缩小 合的最小的必需序列。 11. 在第一年工作的基础上，采用 100对获得的候选蛋白进行质谱鉴定。通过免疫共沉淀等方法对其中感兴趣的候选蛋白进行验证。 12. 对不同阶段细胞进行稳定同位素定量标记研究，收集研究材料进行亚细胞器分级，初步分析标记效率和蛋白质表达情况，利用质谱鉴定部分蛋白质。 13. 通过免疫共沉淀并结合质谱技术，发现新的 互作用蛋白质、制备抗体 ，揭示 14. 通过免疫组化分析的方法在体内验证 路调控新靶蛋白的表达并确定其参与的生物学过程。 15. 合成双链 建果蝇 16. 利用果蝇 过 预期目标 课题一： 1. 确定和 到 1或 2个和 到和人细胞 2. 完成突变株的形态分析。 完成突变株的突变基因的确定。 完成序列对比分析及蛋白功能域的确定。 3. 确定 除它们的基因。完成突变株的形态分析。 4. 验证出 3 5. 6. 确定 7. 确定在 陷型细胞中过度表达 否能校正染色体错排和分离错误，以及恢复动粒功能和检验点应答。 8. 分离纯化若干个与 互作用的有丝分裂相关蛋白，并查询其基本生物功能。 9. 确 定 10. 获得若干个 其中一些蛋白将申请专利。 11. 将稳定同位素标记进入细胞各亚细胞器，获得蛋白质的动态表达数据。 12. 获得 13. 确定 3 14. 完成另外约 5， 000个果蝇基因双链 15. 完成 析选择 3 16. 培养研究生 8名， 培养博士后 4名 。 发表 0的论文 4篇， 的论文 16篇。申请专利 4项。 第三年： 研究内容 课题一： 1. 开始 证和人细胞 2. 研究这些蛋白在细胞生长过程中的动态变化。研究它们是否是 制必需的蛋白。研究它们是作用于 3. 着手开展研究 互作用蛋白在维持 制叉稳定性中的作用。 4. 研究 3因芯片筛选的个蛋白在翻译水平上受 控的方式及其机理（直接调控还是间接调控）。 5. 评价该 3 对肿瘤的发生、发展中的作用。 6. 细胞水平验证 疫共沉淀实验、 7. 从 + 转录为 用生物素标记探针对芯片进行杂交。比较整体基因表达谱与 8. 采用细菌表达的蛋白（ 行体外 立 该细胞系中，或瞬时转染 及 9. 构建含有 酸酶活性失活的哺乳动物表达质粒，检测 产生是否依赖于 时检测存在或缺失 用免疫沉淀（ 测 10. 采用免疫共沉淀等方法对候选的相互作用蛋白进行验证，从中选取 1感兴趣蛋白或是功能未知蛋白，通过基因转染等方法对其进行生物学功能分析。 11. 利用多种质谱系统如 S 和 定不同衰老阶段的蛋白质动态表达和修饰，鉴定修饰位点和修饰类型，进行氧化修饰和组蛋白质及和蛋白质修饰分析。 12. 通过蛋白质相互作用技术，结合使用抑制剂和细胞实时图像技术，揭示 13. 路候选调控蛋白体内外功能分析。构建候选蛋白转基因和敲基因动物模型，观察其表型特点；利用免疫共沉淀等方法确定候选蛋白与 路已知蛋白之间的相互作用。 14. 通过细胞共转染、蛋白分离纯化和质谱分析鉴定 建关键位点 突变的转基因和敲入（ 蝇模型，分析磷酸化位点的功能。 15. 分析 号通路主要蛋白与线粒体功能的相互关系，如 路蛋白与线粒体蛋白的共定位情况、 路对线粒体功能的影响、线粒体对 16. 整理分析数据，撰写论文。 预期目标 1. 确定 互作用蛋白是否在 制起始中起必需作用。 验证和确定人细胞 人细胞 2. 确定这些和 3. 确定 4. 初步阐明 5 5. 初步阐明 3对肿瘤的发生、发展中的作用。 6. 验证出 3 7. 完成基因芯片筛选分析，鉴定出若干由 8. 验证第二年通过分离纯化鉴定的若干 关蛋白与 相互作用是否为直接的。 9. 完成 定 10. 初步探究 或发展的分子机理。 11. 获得细胞核蛋白质动态修饰、修饰类型、修饰位点信息，为进一步功能分析打下基础。 12. 阐明 13. 得到 3选调控蛋白转基因与敲基因果