【基金标书】2011CB504800-病毒潜伏感染的分子机制

项目名称： 病毒潜伏感染的分子机制 首席科学家： 刘奋勇 武汉大学 起止年限： 托部门： 教育部 湖北省科技厅 二、预期目标 本项目的总体目标： 本项目根据我国将人类健康与疾病的生物学基础列为关键基础科学问题这一决策，聚焦国际上病毒学研究的重点和难点，立足于我国重要病毒性传染病的流行特点，选择在我国危害严重、以潜伏感染为特点、同属疱疹病毒科的 研究对象，运用病毒学、免疫学、分子生物学和表观遗传学等手段，结合临床研究，揭示病毒 潜伏感染的分子机制和规律，发现阻断病毒潜伏 /激活的药物靶位点。本项目的完成将在病毒潜伏感染的防控方面取得具有自主知识产权、领先于国际同类研究的创新性成果，提高我国在病毒潜伏 /激活机制等传染病基础研究领域的研究水平和国际影响。 五年预期目标 : 1. 集中和优化项目组成员现有的 续 /潜伏感染神经细胞系 染鼻咽上皮细胞系 1 等细胞模型和鼠疱疹病毒 染小鼠的动物模型，建立潜伏感染并能可控激活的病毒感染 核细胞和 血干细胞的体外 模型，为研究病毒潜伏感染的分子机制提供平台。 2. 发现和鉴定病毒潜伏感染中新的病毒基因产物，阐明病毒转录产物如潜伏转录本 病毒蛋白产物如 在建立和维持病毒潜伏感染、以及它们在肿瘤发生中的作用。寻找和揭示细胞因子在病毒潜伏感染和激活中的作用， 揭示病毒潜伏感染导致重要抑瘤基因 变和功能异常的机制。为病毒的清空性治疗、癌症早期防控和阻断病毒感染的免疫治疗提供新靶标。 3. 阐明 进单核细胞跨血管内 皮迁移以及向巨噬细胞的分化从而实现其在多器官潜伏感染的机制。弄清病毒基因和 /或相关细胞因子如何对 胞、 胞等免疫细胞的功能进行调控，揭示病毒基因在免疫逃逸中的作用及机制。 4. 揭示使神经前体 /干细胞（ 失增殖和分化能力的 关键成分（基因 /抗原），从表观遗传学角度弄清 失增殖、分化能力的分子机制，揭示先天性 染致中枢神经发育畸形的机制。 5. 培养一批在病毒潜伏感染和疱疹病毒研究领域具有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才，造就一支跨学 科、跨领域、精诚合作、团结奋进的科研队伍。培养 80 名博士和硕士研究生，新增国家杰出青年科学基金获得者、中科院“百人计划” 、教育部“新世纪优秀人才”支持计划入选者 2。 6. 在病毒潜伏感染研究领域取得一些开拓性的科研突破，发表一系列具有国际前沿水平的科研论文（ 文 50 篇），在控制病毒潜伏与激活的药物靶标等方面申请国家发明专利 5 项。 三、研究方案 研究方案 1）学术思路： 本项目的总体学术思路是：立足于我国重要病毒性传染病的流行特点，选择在我国危害 严重的代表性病毒为研究对象，聚焦国际前沿的科学问题，以研究病毒、细胞、机体三个方面各自在潜伏感染中的作用为基础，结合潜伏感染在人类重大疾病（小儿神经畸形、鼻咽癌、卡波氏肉瘤等）发生和发展中的作用机制， 揭示以疱疹病毒为代表的病毒潜伏感染和激活的分子机制，为药物和新型疫苗设计提供科学依据。通过本项目的研究，希望形成一支在病毒潜伏感染研究领域具有国际竞争力的优秀团队，契合我国防治病毒性疾病这一重大需求，为保障人民健康提供技术支撑。 本项目拟从 5 个方面开展联合攻关：首先，根据本项目组成员在疱疹病毒研究领域的优势 ，利用已建和新建的病毒 过生物化学和分子生物学方法发现或确定潜伏感染中发挥关键作用的病毒基因（课题一）；其次，根据本项目成员在信号通路、免疫学等方面积累的理论和技术优势，在病毒潜伏感染与激活过程中细胞的信号转导调控（课题二）和机体免疫应答（课题三）等方面展开研究；同时，结合上述研究成果，阐述病毒潜伏感染在神经系统病变（课题四）和肿瘤的发生与发展（课题五）中的作用。课题与课题之间既相对独立，又相互交叉；既在各自的研究领域有创新性，又对其它的课题有指导或借鉴作用。 2）技术途径： 本项目将利 用病毒学、生物化学与分子生物学、细胞生物学和蛋白质组学等方法，在病毒、细胞、机体、临床等多个水平上开展病毒潜伏感染机制研究，为消除病毒的潜在性威胁，研发新的抗病毒药物提供理论依据与技术支撑。 细胞学 在本项目组成员特有 许性感染的神经前体 /干细胞（ 型、伏感染的 经细胞模型的基础上，建立全新的可控激活的 伏感染的人骨髓细胞系模型（单核 血干细胞） ，用于 细胞分化及神经发育畸形等机制的研究；以本项目组成员 特有的 效感染的细胞模型为基础，阐明 染上皮细胞的分子机制；通过不同细胞模型间的相互比较，研究病毒潜伏感染对细胞分化和迁移的影响，及与肿瘤形成的相关性。 病毒学 使用本项目组成员特有的单个病毒基因缺失的 变毒株，在 所建立的潜伏感染模型中系统鉴定 因在病毒潜伏感染中所发挥的作用；比较裂解复制、潜伏感染、激活三种情况下病毒在细胞和动物模型中转录本及蛋白表达谱的差异，阐明病毒在潜伏感染及激活条件下基因的级联表达途径；以本项目组成员特有的鼠疱疹病毒 染的动物模型研究“分子开关” 控潜伏 分子生物学 利用生物化学与分子生物学方法，以病毒蛋白不同的功能结构域为诱饵，通过酵母双杂交筛选、免疫共沉淀和蛋白质质谱分析与其相互作用的宿主蛋白；通过病毒基因定点突变、嵌合体构建等分子生物学手段和生物芯片等技术，找出病毒与宿主 /细胞在建立与维持潜伏感染中的关键分子。 学水平 从蛋白质的磷酸化修饰组学角度分析维持病毒潜伏感染的主要病毒蛋白、宿主细胞因子及其相互作用。以各类疱疹病毒感染宿 主细胞模型，用液相色谱 数据库检索联用的方法进行大规模磷酸化蛋白质组学分析，建立病毒潜伏感染时期的病毒 /宿主细胞磷酸化蛋白质组数据库，分析几种病毒在潜伏时期以及同种病毒在不同时期磷酸化蛋白及位点的差异，揭示病毒潜伏感染的调控机制，为寻找抗病毒的重要分子靶标提供理论依据。 临床调研 充分利用本项目组现有的鼻咽癌标本的采集和管理系统，建成鼻咽癌生物资源库，为开展鼻咽癌的系统生物学研究打下良好基础；收集并系统检测临床卡波氏肉瘤组织样本，明确 在宿主细胞周期调控和凋亡调控中的 功能，并进一步探讨病毒 为治疗靶点和早期诊断分子标志物的可能性。 3) 创新点与特色： 在项目申请团队现有的工作基础上，紧密围绕我国重大病毒性传染病防治的需求，针对病毒潜伏感染前沿科学问题开展联合攻关。本项目的研究内容既相对独立，又相互交叉；既有鲜明的创新性，又是在各自研究工作基础上的合理延伸和拓展。其创新点和特色主要体现在以下方面： 在本项目团队具有优势的研究基础上，聚焦国际前沿科学问题保证了本项目的创新性 病毒感染与致病是一个非常复杂的过程，病毒潜伏是设计药物和疫苗对 病毒进行清除时的特殊难点，本项目针对病毒潜伏这一前沿科学问题开展原创性研究。首先，对于病毒潜伏感染过程中发挥作用的病毒和细胞因子知之甚少，目前仅有少量的病毒基因产物被发现，且功能尚不清楚，因此， 发现和证实新的病毒基因或细胞因子在病毒潜伏和激活过程中的作用， 无论是对阐明病毒潜伏的分子机制、还是对业已潜伏的病毒进行清空性治疗，都至关重要，本项目组成员在系统鉴定和新发现病毒基因功能方面有丰富的经验，做出过重大贡献（ 2003; He et J 2008），为本研究方向的开展奠定了基础。其次，在 病毒感染时细胞的免疫应答和信号调控 方面，本项目组成员通过研究病毒感染时细胞信号转导 （ et J 2004; et 2006; et J 2006; et J 2008） 、细胞迁移和天然免疫的分子机制（ et J 2007; et J 2004），已取得一系列令国内外同行关注的学术成就，已有成熟的技术，通过在潜伏感染中细胞迁移和表观遗传调控方面的联合攻关，可保证所获研究成果的创新性。再次，在 疱疹病毒感染致畸、致癌 方面，本项目组成员的成果填补了国际上 中枢神经发育畸形的研究空白 (et J 2007a, 2007b, 2008, 2010)，在 J. 2009; et J 2009），继续深入研究将保证我国在上述领域的领先地位。总之，本项目从选题和提出科学问题上保证了创新性，充分利用项目团队现有的工作基础，并发挥集中攻关的优势。 立足于我国病毒性传染病的防治，运用多种研究手段从各个层面进行系统性研究是本项目的特色 本项目选择 在我国具有极高感染率、对我国人民健康具有严重危害的代表性病毒为研究对象，聚焦病毒潜伏感染的分子机制这一国际前沿的科学问题， 以研究病毒、细胞、机体各自在潜伏感染中的作 用为基础，结合潜伏感染在人类重大疾病（小儿神经畸形、鼻咽癌、卡波氏肉瘤等）发生和发展中的作用及机制，揭示以疱疹病毒为代表的病毒潜伏感染和激活的分子规律，为药物和新型疫苗设计提供科学依据。 本项目充分利用项目团队已掌握的病毒和临床样本资源，运用病毒学、分子生物学、免疫学、细胞生物学和蛋白质组学等方法，从病毒、细胞、活体（包括临床）等多个层面上开展研究。做到课题 相互渗透、紧密联系，技术相互借鉴和互补。 4）可行性分析： 本项目的总体方案切实可行，相信会取得突破性成果。 人才队伍： 承担本项目研究的课题负责人 和学术骨干是我国病毒学研究领域的优秀中青年科学家、有主持 /负责国家研究项目的丰富经验，多数都是从海外留学归来并已卓有成效地开展工作的研究人员，有丰富的研究成果和研究经验，在病毒学、分子生物学、免疫学、肿瘤医学等领域均做出过重要贡献，以第一作者或通讯作者多次在国际权威期刊（如 J J J J J ）发表过有影响力的论文。 科学问题： 在研究团队已有的工作基础上、根据最新研究动 态提出了聚焦国际前沿的关键性科学问题，学术思想和技术体系具有先进性和可操作性（见 创新性）。 前期基础： 在系统鉴定病毒的基因及其功能、疱疹病毒潜伏感染致畸和致癌机制、病毒感染相关的免疫学研究等方面具有优势力量（详见七和八）。 技术平台： 本项目依托病毒学、华南肿瘤学、病毒基因工程、医药生物技术等 4 个国家重点实验室以及满足病毒研究需要的 验室和实验动物设施，具备完成本项目所必备的实验平台和关键设施设备。本项目预计将在（ 1） 因在潜伏感染和致畸中的作用、（ 2） 表观遗传调控及其致癌机制等方面取得重大突破。 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 伏感染的人骨髓细胞系模型（单核 血干细胞）； 亡受体、凋亡抑制蛋白和的信号级联反应，深入探究这些病毒在潜伏感染期抑制细胞凋亡的调控机制； 3. 开展 染单核细胞 以及促使 单核细胞跨血管内皮迁移的机制 的研究； 染的 本进行预试验 ； 的工作条件，筛选、鉴定与 因组相互作用的病毒 /宿主细胞因子 ； 因的 胞和病毒），合成相应的 细胞内进行初步验证 ； BV 可诱导型慢病毒表达载体，导入鼻咽癌细胞，构建可诱导表达的稳定细胞株 ； 定表达载体； 种膜糖蛋白的表达和纯化，标记。白的表达纯化和标记。 毒的制备和标记； 群（正常人、 性人、鼻咽癌患者）利用 检测 T、 T、 T、 、 L、 毒载量。 毒学等多个层面加以验证。以此作为研究 疱疹病毒潜伏感染机制的重要平台； 毒在潜伏感染期抑制细胞凋亡的调控机制的研究； 染 单核细胞 以及促使 单核细胞跨血管内皮迁移的机制 的研究； 基化、乙酰化的条件和方法。复苏、培养 从临床获得样本建立、鉴定新细胞系； 选出 与 因组相互作用的病毒 /宿主细胞因子 ； 因的 种 可诱导型鼻咽癌细胞株 ； 体的“鱼饵”蛋白。 研究内容 预期目标 第 二 年 用荧光定量 毒潜伏感染时的特异性病毒基因转录产物； 变毒株，在潜伏感染细胞模型中系统鉴定部 170 个基因在病毒潜伏感染和激活中所发挥的作用； 物实验，研究在病毒感染宿主的潜伏期相关基因的启动子的甲基化程度、组蛋白修饰情况（乙酰化 /去乙酰化）、染色质重塑和非编码控、潜伏 病毒基因转录的机制；染对 单核细胞 向 巨噬细胞的分化 的调控机制的研究； 5. 染 究 染 对因 甲基化、乙酰化的影响； 6. 继续筛选、鉴定与 因组相互作用的病毒 /宿主细胞因子 ； 因的 3 体，验证 BV 比较诱导前后细胞蛋白表达谱 (2泳 +质谱分析 )，初步获得 能调控的宿主靶基因；（参考数据库和软件分析结果）； 咽癌细胞基因差异表达谱； 饵”蛋白筛选 效感染的 胞全蛋白库，蛋白组方法鉴定筛选的蛋白； 各种“鱼饵”蛋白流式和免疫共沉淀筛选 受体，质谱鉴定。 毒潜伏感染时的特异性病毒基因转录产物； 0%的基因在病毒潜伏感染和激活中所发挥的作用 ;蛋白修饰情况（乙酰化 /去乙酰化）、染色质重塑和非编码 控、潜伏 染对 单核细胞 向 巨噬细胞的分化 的调控机制的研究； 5. 分析、比较获得的 病毒 /宿主细胞因子 的可能作用，各选择 2代表因子， 着手研究 代表 因子在 伏中的作用 ；BV 受体； 咽癌细胞基因差异表达谱。 。 研究内容 预期目标 第 三 年 伏感染时表达的病毒转录本和潜在的蛋白产物数据，并通过特异性抗体等手段鉴定病毒蛋白的存在。继续利用单个病毒基因缺失的 变毒株，在潜伏感染细胞模型中系统鉴定 部 170 个基因在病毒潜伏感染和激活中所发挥的作用； 数据库检索联用 的方法进行磷酸化蛋白质组学分析； 3. 开展 毒基因和 /或相关细胞因子对 胞以及 胞等免疫细胞功能 （包括细胞激素分泌、细胞吞噬等）的 调控 机制的研究； 染 对 因 甲基化、乙酰化的影响的研究； 表性的 病毒 /宿主细胞因子在 析验证质谱分析结果； 体； 证 光素酶实验鉴定 基因； 效感染的 胞与不感染 5细胞膜蛋白的差异，生物信息学筛选 受体； 导 染 胞，并筛选和确定 合何种糖蛋白 胞，并筛选和确定 合何种 糖蛋白；异性 多肽表位激活体外培养的外周血淋巴细胞，利用 进行 异性 水平 , 异性 细胞 检测。 下 50%的基因在病毒潜伏感染和激活中所发挥的作用； 宿主蛋白质的修饰组学数据库； 阐明病毒潜伏与激活的表观遗传调控机制、寻找抗病毒分子靶标提供理论依据； 毒基因和 /或相关细胞因子对 胞以及 胞等免疫细胞功能 （包括细胞激素分泌、细胞吞噬等）的 调控 机制的研究。 失突变株感染、已有的 因表达载体转染 定病毒基因 /抗原在 因甲基化、乙酰化中的作用； 实细胞 因表达的调控作用，得到获选一系列含野生型和突变性细胞基因的 3 体； 5胞上 受体； 导 入胞的配体； 研究内容 预期目标 第 四 年 技术手段，比较裂解复制、潜伏感染、激活三种情况下病毒在细胞感染模型中转录本及蛋白表达谱的差异，研究病毒在潜伏感染及激活条件下基因的级联表达途径，通过酵母单 杂家或双杂交筛选、免疫共沉淀和蛋白质质谱分析与病毒基因产物相互作用的宿主蛋白； 感染所引发的细胞周期停滞的分子机理进行比较研究，研究可能的控制靶点； 毒潜伏感染的主要病毒蛋白、宿主细胞因子的研究。 因 甲基化、乙酰化改变的 抗原； 5. 继续 研究 代表性的 病毒 /宿主细胞因子在 伏中的作用 ； BV 控细胞基因表达的作用机制（位点、序列）； 入相应的抑制剂，考察 关基因表达情况和其存在状态； 体在感染 胞的作用，并确定游离 染 胞的分子机制； C 细胞通过紧密接触反式感染鼻咽上皮细胞的作用。 定可能的控制靶点。 毒潜伏感染的主要 病毒蛋白、宿主细胞因子的研究。； 因 甲基化、乙酰化改变的 键的基因 /抗原； 5. 完成 代表性的 病毒 /宿主细胞因子在 伏中的作用的研究 ； 明 宿主细胞基因表达的调控及其 的分子机制 ； 明 宿主 染 胞细胞的分子机制； 介导携带 胞通过紧密接触反式感染鼻咽上皮细胞中的作用 。 研究内容 预期目标 第 五 年 嵌合体构建等分子生物学手段和生物芯片等技术，找出病毒与宿主 /细胞在建立与维持潜伏感染中的关键分子；寻找共性的信号转导通路； 毒蛋白、宿主细胞因子的相互作用的研究； 4. 研究 键的基因 /抗原导致 因 甲基化、乙酰化改变的信号通路； 伏感染的关键因子的信号通路和 伏感染对细胞行为的影响 ； 析 伏感染、免疫逃逸或致癌等过程中发 挥的作用； 基因与鼻咽癌临床病理及预后的关系；5配体，反向验证筛选的体是正确的 ； 结 细胞对体液和细胞免疫应答的影响。 2. 验证所获得的与病毒基因产物相互作用的宿主蛋白； 4. 完成新的 主细胞因子的相互作用的研究； 5. 研究 键的 基因 /抗原导致 因 甲基化、乙酰化改变的信号通路， 获得初步结果为下一步工作做准备。 伏感染对细胞行为的影响，获得初步结果，为进一步研究 铺垫。 伏及致癌中的作用； B 病毒潜伏感染相关分子标记，用于鼻咽癌早期诊断和预后预测 ； 携带 胞分别感染鼻咽上皮细胞的分子模型。 一、研究内容 本项目将重点围绕确定病毒潜伏感染相关基因、发现潜伏和激活相关细胞因子及表观遗传调控机制、阐明病毒潜伏与重要疾病（神经发育畸形、肿瘤）的关系等开展以下研究： 1、潜伏感染的病毒学 病毒在建立和维持潜伏感染中关键基因的确定 在现有的 疱疹病毒持续 /潜伏感染的细胞模型和 染小鼠的动物模型基础上，建立潜伏感染并能可控激活的 核细胞和 血干细胞的体外模型。在上述模型中，采用本项目组特有的 个基因缺失系列突变株等特色病毒资 源，系统测试病毒各基因缺失后对潜伏感染的影响。 病毒潜伏感染时的转录本 利用上述细胞或动物模型，结合荧光定量 技术，分别在群体细胞和单个细胞（激光捕获）水平上分析潜伏和激活时 病毒转录本的变化，确认病毒潜伏感染时的基因转录产物。阐明这些基因产物在维持潜伏感染中的作用。 病毒 潜伏感染中的功能 研究 潜伏感染时产生的 对应的病毒或细胞靶标，为病毒潜伏感染和感染引起的细胞特殊表型的形成原因提供可能的解释 。 控 疹病毒潜伏、激活的分子机制 确定和分析介导 子开关” 激活的顺式元件，探索 2、潜伏感染的细胞生物学及免疫学 受感染细胞分化和迁移的调控 阐