早期和晚期人体恶性肿瘤中循环肿瘤dna的检测

早期和晚期人体恶性肿瘤中循环肿瘤DNA的检测CHETANBETTEGOWDA,1,2MARKSAUSEN,1REBECCAJLEARY,1ISAACKINDE,1YUXUANWANG,1NISHANTAGRAWAL,1,2BJARNERBARTLETT,1,3HAOWANG,1BRANDONLUBER,1RHODAMALANI,4EMMANUELSANTONARAKIS,1NILOFERSAZAD,1ALBERTOBARDELLI,5,6,7HENRYBREM,2JOHNLCAMERON,2CLARENCECLEE,8LESLIEAFECHER,9,10GARYLGALLIA,2PETERGIBBS,11,12DUNGLE,1,3ROBERTLGIUNTOLI,2MICHAELGOGGINS,2MICHAELDHOGARTY,13MATTHIASHOLDHOFF,1SEUNGMOHONG,2,14YUCHENJIAO,1HARTMUTHJUHL,15JENNYJKIM,1GIULIASIRAVEGNA,16DANIELALAHERU,1CALOGEROLAURICELLA,16MICHAELLIM,2EVANJLIPSON,1SUELYKAZUENAGAHASHIMARIE,17GEORGEJNETTO,2KELLYSOLINER,18ALESSANDROOLIVI,2LOUISEOLSSON,19GREGORYJRIGGINS,2ANDREASARTOREBIANCHI,16KERSTINSCHMIDT,1LEMINGSHIH,2SUELIMIEKOOBASHINJO,17SALVATORESIENA,16DANTHEODORESCU,20JEANNETIE,11TIMOTHYTHARKINS,8SILVIOVERONESE,16TIANLIWANG,2JONDWEINGART,2CHRISTOPHERLWOLFGANG,2LAURADWOOD,2DONGMEIXING,2RALPHHHRUBAN,2JIANWU,1,21PETERJALLEN,22CMAXSCHMIDT,23MICHAELACHOTI,2VICTOREVELCULESCU,1|KENNETHWKINZLER,1|BERTVOGELSTEIN,1|NICKOLASPAPADOPOULOS,1|LUISADIAZJR1,3|如何发展无创的方式去发现和监视肿瘤一直是肿瘤学中的一个主要挑战。我们在640位有着不同种癌症的患者身上采用基于数字化PCR的技术去评估肿瘤循环DNACTDNA探测癌症的能力。我们发现75有着晚期胰腺，卵巢，结肠，膀胱，胃，乳腺，黑色素，肝细胞或头颈部癌症的患者体内的CTDNA是可探测的，但是只有不到百分之五十患有原发性脑，肾，前列腺或甲状腺癌的患者中可探测到CTDNA。在有着局部肿瘤的患者中，结肠癌，胃癌，胰腺癌和乳腺癌CTDNA的可探测率分别是73,57,48和50。CTDNA经常出现在没有循环肿瘤细胞的患者中，暗示这两种生物标记物是不同的存在。在有着206名转移性结肠癌患者的一组单独实验对象中，我们发现有临床相关KARS基因突变的CTDNA可探测率是872，且特异性是992。最终，我们在24位对治疗有着客观响应但随后复发的患者身上对CTDNA是否能够提供表皮生长因子受体抑制剂潜在抗性机制的线索进行评估，这些患者中的23人96在涉及促分裂原活化蛋白激酶通路的基因中发展出一个或更多的突变。总之，这些数据暗示CTDNA是一个明显适用的，敏感的和特异的可被用于在有着多种不同癌症的患者身上进行临床和研究目的的生物标记。简介在美国，癌症今年就会发生在多于160万的个体身上，但是一个经过临床证明的可以用来帮助指导病人管理的循环生物标记只适用于他们中的少部分，甚至是在广泛转移的设置中16尽管基于血浆的蛋白生物标记比如癌抗原125CA125,癌胚抗原CEA和前列腺特异性抗原PSA通常用于这一目的，但这些蛋白也存在于不患癌症的个体的血浆中，虽然浓度较低24此外，在晚期癌症患者体内这些标记并没有被发现相当大程度的增加5,6。随着负责人体癌症产生和发展的基因改变的发现，寻找新一代生物标记成为了可能711。随着源自近来癌症基因测序研究的基因信息的汇总，现在已知几乎每一种癌症都有体细胞基因改变。这些改变包括单碱基替换，插入，删除和易位（后者包括那些与基因融合，基因扩增或杂合性缺失的产物）。这些体细胞突变以可忽略的频率发生在普通细胞群体中并因此提供从生物学视角上坎精巧的特定生物标记。有两种肿瘤DNA可以在循环中被非侵入性的评估无细胞肿瘤循环DNACTDNA和循环肿瘤细胞（CTCS）12,13。CTDNA由与细胞或细胞碎片无关的核酸小碎片组成。相反，CTCS展现着完整，经常是存活的，可通过物理化学特性或者区别于其他普通血细胞的细胞表面分子从血液中纯化的细胞15。尽管只有少量的研究比较过同一病人体内的CTCS数量和CTDNA模板1619，但许多研究已经表明CTDNA和CTCS都出现在晚期肿瘤中。比较这两种的方法的研究出现了相反的结论，很可能是因为技术问题限制了对CTDNA或CTC成分的理解。此外，尽管CTDNA真的可能来自CTCS，但是CTDNA或CTC释放入循环系统的机制尚不明确。这一研究的目的之一就是对同一病人采用无偏倚方法后比较CTDNA和CTCS在循环中的含量。至今大部分CTDNA的研究各自评估有着单型肿瘤的患者。鉴于这些研究中DNA的准备和分析技术有着显著的不同，所以很难去直接比较不同肿瘤类型CTDNA的含量16,2026。因为数据报道形式的不同，研究间的比较同样也很有挑战性。举例来说，比较实时聚合酶链式反应的结果和那些评估突变模板分子碎片的结果是几乎不可能的，或者用基于血清分析的结果去比较基于血浆分析的结果，也同样不可能。为了直接比较不同类型的癌症和为了确定临床应用CTDNA测量有效的癌症的光谱，我们在当前研究中评估了大量类型的癌症。我们对所有样品使用标准化指南提纯血浆和肿瘤DNA并使用数码技术评估每种肿瘤的CTDNA水平，从而使我们能够报道每个案例每毫升血浆的突变模板数FIG1这个方法也可以使我们直接比较两种在循环中发现的最常见的肿瘤特异性遗传学变化形式单基因替换和重排。CTDNA最直接的应用之一被术语化为“液体活组织检查”20在研究和临床实践中，很难获得用于基因分析的肿瘤样本。一些肿瘤（比如肺癌）只有通过细针穿刺才能得到并不足够用于基因型分析的材料，反之在其他情况下从不同医疗中心获取样本会很有挑战性或者很耗时27此外，一旦一个靶向治疗用于有着多种转移瘤的病人，临床医生可以经常寻找复发的早期证据或者潜在抗性的机制，这是一种液体活组织检查特别有价值的情况。例如，他们可以提供全部肿瘤负荷的暂时性测量值和识别治疗期间上升的特异性基因突变16,20,21,23,28,52尽管液体活组织检查的方式证明是有前途的，但它相关于传统肿瘤活组织检查的敏感性和特异性并没有在一个大的临床相关群组中被评估。这里，我们在使用表皮生长因子受体抑制剂结肠癌患者CRCS身上评估这一方法的特异性和敏感性。我们也使用液体活组织检查的方法在最初应答表皮生长因子受体抑制剂的患者身上鉴别负责复发的的基因突变。总的来说，对CTDNA测量用于评估有不同癌症的患者，这些研究提供了其潜在价值与局限的丰富信息。结果有着转移癌的患者我们从评估来自14种不同组织类型的136例转移癌和41位有着原发性脑肿瘤（神经胶质瘤和成神经管细胞瘤）的患者开始这项研究。原发性脑肿瘤被包括在这项评估内是因为尽管它几乎不转移但它通常是致命的。我们同样也包括了10例额外的案例，由三期卵巢癌（N7）和肝细胞癌（N3）组成，这个特别的评估是因为四期案例非常稀有并且在这两种癌症中三期疾病更具有晚期肿瘤的代表性。这些患者的临床特征被总结为表一。靶向测序，外显子测序或全基因组测序被用来识别癌症中的基因突变，就像辅助材料及方法中描述的那样。在这些晚期案例中，至少一个基因改变一个点突变（151例）或者基因重排（36例）被发现在每一个癌症研究者中S1表。除了在KRAS,NRAS,PIK3CA,和BRAF（众所周知体细胞中的）这些已知热点基因中发生基因突变的子集外，通过评估同一患者非肿瘤性细胞的DNA，所有其他基因突变被证明也发生在体细胞中。CTDNA通过三种数字化方法中的一种进行评估（见补充材料和方法）。当应用于同一血浆样本，这些方法产生了可比较的结果（图S1）并且从5ML血浆提纯的DNA中全部可以探测到一个突变模板。每个病人的可用血浆数量列在表S1中。大部分有着脑外实体瘤的被研究患者被检测到CTDNA112/13682然而，有着可探测CTDNA的部分患者因肿瘤种类而异似然比检验,P0001如图2A和图S2所示，大部分有着三期卵巢癌，肝癌和胰腺，膀胱，结肠，胃，乳腺，肝脏，食道和头颈部转移癌，以及成神经细胞瘤和和黑色素瘤的患者有着可探测水平的CTDNA。相反，少于50有着成神经管细胞瘤或肾脏，前列腺，甲状腺转移瘤的患者和少于百分之十有着神经胶质瘤的患者有可探测水平的CTDNA。有着图2A描述的肿瘤类型的患者数量是很少的，这限制了不同类型肿瘤间比较的统计学意义，但有着神经胶质瘤（低或高水平，表S1）的患者相比有着胰腺，结肠，乳腺，食管/胃或者卵巢转移癌的患者更低可能有CTDNA（图2A和图S2）。尽管CTDNA在大部分有着转移癌的患者中是可检测的，但CTDNA的浓度因病人而异，甚至是在那些同种类癌症中（图2B和表S1）。有些这种变率是因为在不同肿瘤中化验基因的拷贝数是不一样的。举例来说，如果患者A肿瘤中的待测基因放大50倍，然而患者B肿瘤中的待测基因呈现正常的拷贝数，那么患者A的CTDNA量预期是患者B的50倍（见“CTDNA中单碱基替换与重排的比较”）。然而，在只有非放大基因例如TP53被评估的癌症中观测到很大程度的变异性。有着局部疾病的患者我们下一步评估有着局部疾病患者体内的CTDNA，就是说，在样本采集期间没有临床上或者放射线检查的远端转移证据。在有着所有被评估种类局部癌症的233名患者中，55患者体内发现可探测水平CTDNA（233名患者中的122名，表S1）。这部分低于来自所有肿瘤类型有着充足可用样本的转移性疾病患者（乳腺，结肠，胰腺和胃食管；图3A；模型拟合及分层卡方检验；P0001）的观测值。可检测水平CTDNA出现在49到78有着这四种局部肿瘤的患者中以及86到100有着这四种转移性肿瘤的患者中（图3A）。有着可探测水平CTDNA患者比例的不同也与病程有关47一期任何癌症的患者有着可探测CTDNA，然而2，3，4期癌症病人有可探测CTDNA的比例各自是55，69和82（图3B,萨默斯指数等级相关0337）。同理，血浆中CTDNA浓度随着病程上升。比较CTDNA和CTCS这些实验中，DNA孤立于离心分离后得到的血液中的细胞区室，这些颗粒包括CTCS和白细胞（WBCS），血小板，和其他细胞成分。在每个样例中，肿瘤DNA的全基因组测序被用于鉴别体细胞重排。基于PCR的试验被用于识别相同患者那些血液颗粒CTCS或者血液上清液血浆中的重排。这些实验可以在肿瘤特异性重排下进行但不能在肿瘤特异性点突变下进行，原因见讨论。我们没有识别到任何CTCS可探测但CTDNA不存在的案例。然而在许多CTDNA可被检测到的情况下1中13个81，没有CTCS可在相同实验中被探测表2此外，在CTCS和CTDNA水平都可检测的三个案例中，血浆中突变碎片的平均数量大于50被CTCS中的类似水平。CTDNA中单碱基替换与重排的比较我们也感兴趣于比较同一患者的循环中两种不同种类DNA碎片的基因学改变。尽管这项研究中实际问题使我们不能鉴别所有患者中的基因重排（见讨论），但在19名患者中肿瘤特异性重排和肿瘤特异性点突变被识别（表S2）。一个例外是一名在TP53有着循环点突变的患者，这名患者肿瘤中的重排鉴定不能在她的血浆中被识别（表S2）。有着点突变的循环DNA碎片的绝对数量相对重排是高度相关的（图4；相关系数096）。然而，在四名病人体内，含有重排的循环碎片数量大于十倍含有待测点突变的循环碎片数量（表S2），这一现象的原因是我们选择用来分析重排的基因在肿瘤中经常出现基因扩增的结果，然而点突变通常在每个肿瘤基因组中只出现一次。液体活组织检查的敏感性和特异性上述结果是通过首先在肿瘤中识别基因突变然后测定血浆中是否有相同可探测突变的方法获得的。对特定液体活组织检查的应用，肿瘤的基因突变事先未知并且所有相关突变被马上标为待测。为了测定液体活检方法的敏感性，我们盲法评估206名有着转移性CRC患者的血浆和肿瘤（表S3）。这一队病人完全独立于上文提及和在S1,S2表中的410名病人。对每例样本，我们界定KARS第12，13位碱基突变是否既在原发性癌又在2ML治疗前抽提血浆中出现。KARS基因被选中用于这一研究是因为它的临床相关性；在原发性肿瘤中KARS基因突变的出现是使用抗体抑制EGFR来治疗转移性CRC患者的先决条件29。我们识别了69名患者在血浆中有着循环突变KARS206人中的33。128名有着KARS野生型癌症的患者中127人没有被检测出循环KARS突变，得出未修正的特异性992。在69例血浆样本中鉴别到的基因突变与肿瘤中鉴别到的完全相同，进一步强调了液体活组织检查的特异性。除了这69例肿瘤，我们鉴别了10例（206例中）基因突变出现在原发性肿瘤但不在血浆中的样本，得出敏感度是872。在血浆和肿瘤组织中KARS突变状态一致的比例是95，并且一致认为是高度显著K088，P00001为了更好地理解观测到的假阴性结果，我们下一步评估了26个临床和病理学特点，（表S3和S4）。与假阴性CTDNA结果（肿瘤中有KARS基因突变但是血浆中没有可探测基因突变）相关的的现象是低CEA水平，黏蛋白组织学，低水平丙氨酸转氨酶，WBC数量少，和更年轻（表S4和S5）。CEA水平也显然与血浆中突变KARS碎片浓度有关（表S6与S7）。低肿瘤负荷（从通常CEA水平中体现）与低CTDNA水平相关的这一想法与观测值是一致的。我们下一步检测CTDNA浓度与存活率的关系。从一个有着已知预后因素（年龄，东部肿瘤协作组ECOG体力状况PS，和CEA）的模型开始,并假设这些评估变量是线性的，我们发现CTDNA浓度为预测存活提供了附加价值（似然比检验，P000253,DF3）。随后我们评估不同CTDNA水平的两年存活率，包括其他预测变量（图5）。我们观测到随着CTDNA浓度的上升存活率稳定下降检测患者的抗性获得基因突变液体活组织检查同样可用来监控靶向药物治疗的患者，提供复发的早期预警和抗性的遗传学基础的信息。举例来说，KARS第12，13位密码子突变出现在24名患者中的38，这些患者最初响应了EGFR抑制剂但随后疾病进展（20）。在每个案例中，KARS基因突变没有出现在原发性肿瘤中但推测起来产生在转移病灶的少量细胞中，并在EGFR抑制剂的影响下扩散。这里我们希望确定除了在KARS12，13碱基处的突变外，是否有其他的抗性突变可以在EGFR抑制剂治疗患者的液体活组织检查中发现。我们因此设计了一个多路，基于测序化验去检测EGFR通路几个基因中的已知突变热点在KARS第12，13，59，60和61碱基位点内和周围的区域；NARS第12，13，59，60和61碱基位点；BRAF第599和600碱基位点；EGFR第712至721，738，748，790至800，和847至895碱基位点；以及PIK3CA第538至549和1039至1050碱基位点。24个被评估的案例中包括17个之前评估过KARS基因突变的案例（20）和7个额外的患者使用EGFR抑制抗体治疗，最初应答但随后病程进展的案例（帕尼单抗或西妥昔单抗）。这些案例中九个有着原发性癌症的案例是不能利用的，所以我们使用血浆中预处理过的DNA去评估是否任一获得性基因突变在EGFR抗体使用前都是可探测的。图6中列出的基因突变没有能在抗体治疗前被发现。在24名患者中我们识别到23人（96）在胞外信号调节激酶通路基因有着至少一个自发的循环突变。每个患者的循环中识别到的不同突变数平均值为29（区间012）同一患者中不同突变的的发展为自身的多发性病变是并不奇怪的；每种响应EGFR阻断剂的病变被期望拥有至少一个耐药性突变（20,30）总共，我们观察到70例在使用EGFR阻断剂之前没有肿瘤或者血浆中检测到的体细胞突变，只出现在治疗开始之后（表S8和图6）一般的突变（70中的34例）出现在KARS第12密码子。当这些突变出现在原发性肿瘤中被认为导致了EGFR阻断剂的抗性，并被观察到使用EGFR阻断剂后水平提高不论是在体内还是体外（20,30）。BARF中的一个突变被观察到。之前的几项研究表明BRAFV600E突变，当出现在原发性肿瘤中时，与无法响应EGFR阻断剂相关（3133）。两个其他患者在EGFR激酶结构域出现突变（密码子714和794，表S8和图6）。这些筛留物中的突变之前在原发性CRC中被观测到，虽然并不经常，同时EGFR阻断剂的抗性显示是由EGFR基因遗传学改变所导致（34,35）。我们没有识别在已知PIK3CA基因热点的治疗相关突变（外显子9和20）（36）我们研究组成中最让人惊讶的EGFR阻断剂观察是KRAS或NRAS基因61位密码子的大量突变（表S6和图6）24位患者中的15人（625）拥有至少一个61位密码子突变，这15位患者拥有所观测到的总计31个突变的百分之45（69），48的61位密码子突变出现在NRAS其余在KRAS中（表S6和图6）讨论通过所研究的640位患者，我们发现突变DNA碎片相对较多的集中在转移性癌症中被发现，以及在大部分有着局部癌症的患者中有着较低但是可探测的水平。这些结果有着多种可解读的含义以及为将来的研究建议了重要的途径。检测晚期癌症患者的疾病一个遗传性改变可以在这部分研究评估的所有410位患者的肿瘤中被识别，使得CTDNA对癌症患者来说是一个可广泛应用的生物标记。此外多于80有着转移性疾病的患者有着可探测水平的CTDNA，高于大部分有记录的常用生物标记（37）与既在普通细胞又在肿瘤细胞中表达的CEA或者CA199蛋白质不同，克隆性的遗传学改变只出现在肿瘤中。我们的数据指出CTDNA的测量同样可以提供有着转移性癌症患者的治疗方法，预测以及预后方面的信息。如图5所示，有着相当低水平CTDNA的转移性CRC患者比高水平患者的寿命显著延长，并且在CTDNA浓度和存活率间有着显著相关性。一个存活率与CTDNA浓度间类似的相关性最近在晚期乳腺癌患者中被报道（16）。尽管CTDNA这些优点使得它对于监控患者是很有前途的，但也有潜在的局限性。特异的突变被原发性癌症的评估所界定，对于患者的管理既需要投入时间也需要费用。将来这会变得阻碍更小，因为更多的癌症患者将会对他们的肿瘤进行遗传学分析以便于指导治疗决定。这些过去常常用于指导治疗的遗传学改变同样可被用于CTDNA分析。涉及监控晚期癌症患者的实用性的一个更严肃的问题是，使用CTDNA还是生物标记（38，39）。一方面，患者和他们的内科医生焦急地想尽快知道疾病是否进展。设想研究经常是无告知性的或者迟钝的反应疾病进展。再设想受试患者受到辐射，但是CTDNA的监测是非侵入性的。另一方面，尚未显示使用任何生物标记监控晚期癌症患者在临床上有着类似于对心理效益的不利。在转变为临床症状前知道进展（或应答）可能并不会延长生存或提高生命质量。方法论的比较血液中有两类可获得的肿瘤DNA（CTCS和CTDNA），两种类型的遗传学改变可以在任一类型中很容易的被评估（点突变和易位）。早先比较CTDNA与CTCS的研究得到了混合的结论。举例来说，一个小组得出CTDNA的出现少于CTCS的结论（17）；这一组使用体现最高技术水平的方法去探测CTCS但是并没有使用高敏感性的方法去探测CTDNA。第二组得出的结论是CTDNA比CTCS更经常的出现（16）；这一组使用一种灵敏的方法去分析CTDNA但是使用了几乎不敏感的方法去探测CTCS。最近以来，在三名小儿成神经细胞瘤患者中的两位发现CTDNA的水平远高于CTCS（19）。为了进一步研究这个问题，我们对来自有着典型实体瘤患者的同一血液样本同时评估CTDNA与CTCS。我们仅把细胞性成分与血浆分离并鉴定细胞部分或细胞类似物，分别的，这其中的肿瘤特异性重排可以被鉴定。因为我们没有试图事实上从普通白细胞计数中分离肿瘤细胞，关系