关于b基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系研究

实验设计已知1A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用；2心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。实验目的1明确B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系；2明确在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中。实验1关于B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系研究实验方法8组小鼠（4组野生型，4组敲除B基因）接受皮下注射5MGKG1的ISO，对照组接受生理盐水注射，每型（野生型或敲除型）小鼠分别于1天、3天、6天杀死。按下表进行组别空白对照基因敲除对照1D缺血3D缺血6D缺血基因敲除1D缺血基因敲除3D缺血基因敲除6D缺血缺血基因敲除用兔抗CASPASE3一抗和脱氧核苷转移酶法、HE等方法对心肌细胞进行染色，通过心电图、组织形态学观察和外周血CTNI含量评估细胞损伤情况。死亡的心肌细胞通过荧光共聚焦显微镜辨别。心电图示例组织学观察示例然后用免疫组化方法测定B蛋白表达量。上述各组细胞每组各取1皿，吸弃培养液，PBS洗3次，甲醇固定5MIN，PBS洗3次，加入封闭液，37，3060MIN，吸去上清液；加一抗，37恒温12H后置4冰箱过夜。第二天取出，PBS洗3次；加二抗，37恒温12H后，PBS洗3次，加03H2O2PBS，37，30MIN；PBS洗3次；加SABC工作液，37，30MIN；PBS洗3次；DAB显色，镜下控制，以蒸馏水终止反应后观察结果。也可以按如下方法1大鼠心肌细胞原代培养。取大鼠一只，无菌条件下取出心脏，缓冲液清洗，将心脏剪成1CM3小块，有胰蛋白酶和胶原蛋白酶消化交替进行消化处理，消化时置于37水浴磁力搅拌器上，每次8MIN。取上清加入含10胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心后，去上清，用含10胎牛血清的培养基重悬细胞，保存于37CO2培养箱。将心肌组织分次消化收集，最后将收集的细胞悬液用200目滤网过滤，将过滤后的细胞悬液置于培养皿中，于5二氧化碳、37培养箱中贴壁2H。收集未贴壁的细胞悬液，加入01MMOL/LBRDU，吹打后接种于35MM培养皿（2ML/皿），接种后48H首次换液，继续加入01MMOL/LBRDU，心肌细胞培养5D。2建立心肌细胞缺血模型。5D后，取12皿，弃去10胎牛血清的DMEM低糖培养基，每培养基加入2ML不含血清的DMEM无糖培养基，其中6皿加入B基因的抑制剂，在05氧气，5二氧化碳，945氮气，37条件下培养，分别在1H、2H、3H后分别取出2皿普通缺血和2皿加入抑制剂的，进行后续实验，构成1H普通缺血组，2H普通缺血组和3H普通缺血组以及1H抑制剂缺血组，2H抑制剂缺血组和3H抑制剂缺血组。未缺血培养的取4皿，2皿正常培养，2皿加入抑制剂，构成空白对照组和抑制剂对照组。并用CCK8法测细胞活力。每组取剩余的一皿，吸弃原培养液，加CCK8工作液，继续培养，待CCK8作用1H，在450NM波长处比色，测定吸光度，分析各皿心肌细胞活力。组别空白对照抑制剂对照1H缺血2H缺血3H缺血1H缺血抑制剂2H缺血抑制剂3H缺血抑制剂缺血抑制剂之后用免疫组化方法同前。实验结果分析（1）若B基因的表达量随缺血时间的增加即细胞活力下降而相对增加，可认为B蛋白参与缓解心肌细胞缺血损伤。（2）若B蛋白表达量随缺血时间增加而相对增加，但敲除B基因后，细胞活力降低程度减少，说明B蛋白可能在损伤发生后促进细胞凋亡。（3）若B蛋白表达量随缺血时间增加而下降，且野生型和敲除型中细胞活性降低程度相仿，则认为可能是因心肌细胞缺血损伤导致B蛋白表达量下降，说明B蛋白参与未损伤时的正常生命活动，在损伤后，该正常活动被破坏。实验2A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中。1药物组和对照组设立。取野生型和敲除型小鼠各4组依照实验1的方法进行心肌缺血模拟，之后进行如下处理3依照实验1中的方法对细胞进行免疫组化测定B蛋白表达量和细胞活力测定。实验结果分析（1）若药物组心肌细胞缺血损伤缓解，敲除组损伤加剧，药物敲除组损伤介于二者之间则说明B蛋白可能参与A药物的作用，但同时A药物也可以通过其他通路挽救心肌损伤。（2）若药物组心肌细胞缺血损伤缓解，敲除组损伤加剧，药物敲除组损伤同抑制组，说明B蛋白参与A药物的作用，且A药物必须通过B作用。（3）若药物组损伤缓解，敲除组损伤加强，药物敲除组损伤也缓解，说明B蛋白不参与A药物的作用。主要参考文献ELLISON,GM,TORELLA,D,KARAKIKES,I,PURUSHOTHAMAN,S,CURCIO,A,GASPARRI,C,INDOLFI,C,CABLE,NT,GOLDSPINK,DF,ANDNADALGINARD,B2007ACUTEBETAADRENERGICOVERLOADPRODUCESMYOCYTEDAMAGETHROUGHCALCIU