细胞外基质促血管平滑肌细胞迁移及β3整合素和粘着斑激酶表达

细胞外基质促血管平滑肌细胞迁移及3整合素和粘着斑激酶表达中国病理生理杂志CHINESEJOURNALOFPATHOPHYSIOLOGY2003,192163166文章编号10004718200302016304细胞外基质促血管平滑肌细胞迁移及L33整合素和粘着斑激酶表达刘智敏,韩梅,温进坤河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室,河北石家庄050017163摘要目的研究细胞外基质E伽蛋白促血管平滑肌细胞VSMC迁移与岛整合素及粘着斑激酶FAK表达之间的关系方法应用细胞迁移实验观察骨桥蛋白OPN和纤连蛋白FN对VSMC迁移活性的影响,利用RTPCR和WESTERN印迹探讨岛整合素,FAK和转录因子GAX表达与细胞迁移之间的关系结果VSMC经1O,20MG/LOPN和20MS/LFN处理后,迁移活性分别达对照组的136,157和126倍P005用相同浓度2OMG/LOPN和FN刺激细胞,随着作用时间延长,VSMC迁移距离逐渐增加WESTERN印迹和RTPCR结果证实,两种基质蛋白促进VSMC迁移与诱导岛整合素和FAK基因表达及抑制转录因子GAX表达有关结论岛整合素一FAK是介导OPN和FN促VSMC迁移的信号途径之一关键词细胞外基质蛋白肌,平滑,血管结合素类局部粘着中图分类号Q249文献标识码A细胞与细胞外基质EXTMCELLULARMATRIX,ECM之间的相互作用是血管平滑肌细胞VASCULARSMOOTHMUSCLECELL,VSMC粘附,迁移,增殖和分化的分子基础在正常血管壁中,通过ECM与VSMC的相互作用,使VSMC保持分化状态在动脉粥样硬化,血管再狭窄发生发展过程中,可通过ECM的降解,合成及重新编辑使ECM发生重构细胞与ECM之间的相互作用是由ECM蛋白受体整合素INTEGRIN介导的越来越多证据表明,整合素不仅作为ECM的粘附分子发挥作用,而且还能够将细胞外的刺激信号转入细胞内,介导ECM蛋白及生长因子所引起的细胞增殖及迁移反应我们以往的研究证实,处于增殖状态的合成型,去分化型VSMC可合成分泌骨桥蛋白OSTEOPONTIN,OEN和纤连蛋白FIBRONECTIN,FN等ECM蛋白J当体外培养的VSMC生长至融合并出现接触抑制时,在培养液中可检测到高浓度的OPN存在,此时,VSMC的迁移活性也大大增强,基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达活性升高3在此基础上,本研究从细胞一ECM相互作用的角度,进收稿日期20020513修回日期20021009基金项目国家自然科学基金资助项目NO39970274河北省自然科学基金资助项目NO301358通讯联系人TEL031160441215563EMAILWJKHEBMUEDUCN一步探讨ECM蛋白促VSMC迁移与融整合素及粘着斑激酶FOCALADHESIONKINASE,FAK表达之间的关系材料和方法1试剂M199培养基购自GIBCO公司反转录试剂盒和SYBRGREENPCR试剂盒为PE公司产品PCR引物由上海生工生物有限公司合成抗融整合素抗体和化学发光试剂盒购自中山公司FN由北京大学医学部细胞生物学教研室提供OPN为本室制备2MC培养及实验分组选用5周龄雄性SD大鼠,取胸腹主动脉,按贴块法分离,培养VSMC025胰蛋白酶消化传代,取4一LO代细胞进行实验传代培养的VSMC生长到80融合时,无血清饥饿培养24H,使细胞同步于G0期加入不同浓度的FN或OPN0,5,10,20MS/L,以含有15新生小牛血清NCS的ML99作对照,分别于培养L2,24,36H后收集细胞,进行下列实验3细胞迁移分析在盖玻片上生长的VSMC长至”峰和谷”状态后,取出玻片,用无菌刀片刮除玻片一侧的细胞将玻片置于含上述不同影响因素的培养液中,继续孵育一定时间后取出,进行固定和HE染色,于高倍镜下,选取5个视野,用测微尺量取迁移起点距迁移最远端细胞核之间的距离,以此表示VSMC迁移活性4RTPCR采用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法分别从被不同因素处理的VSMC中提取细胞总RNA,以此为模板,以OLIGODT16为引物,按照PE公司TAQMAN反转录试剂盒说明书合成CDNA以CDNA为模板,分别加入大鼠FAK和GAXCDNA上,下游引物,按照SYBRGREENPCRKIT说明书进行PCR,以GAPDH为内参照所用引物序列如下FAKCDNA上游引物5ACTRGGACGITAAG3下游引物5TCACGIIGTCCG从GTACAG3GAXCDNA上游引物5CTGCTCACCCGCGC3,下游引物5TCACGAACCAAAGRRCC35WESTERN印迹分析用RIPA细胞裂解液1NP40,1SD,150MMOL/LNACI,50MMOL/LTNSCI,PH75,10GLYCEROL,IMMOL/L钒酸钠,IMMOL/LPMSF裂解细胞后分离上清,用改良LOWRY法进行蛋白定量取100TTG蛋白进行SDSPAGE分离,电印迹至硝酸纤维素NITROCELLULOSE,NC膜上将印迹的NC膜依次进行封闭,与第一抗体,第二抗体结合,抗体结合区带用化学发光法检测信号强度用KODAKID图像分析软件进行定量分析结果LOPN,FIN对MC迁移活性的影响细胞迁移分析结果显示,用5,10,20MG/LOPN处理24H的VSMC,其平面迁移活性分别为对照组15NCS的1O4,136和157倍低浓度的FN5,10MS/L不能诱导VSMC迁移,仅在高浓度2OMS/L时有促细胞迁移的效应随着OPN,FN作用时间延长,VSMC的迁移距离也相应增大图1BCFIG1VSMCMIIONSTIMUHTEDBYOPNANDFNAEFFEETSOFOPN20MG/LDFN2OMG/LONVSMCMIGTIOINDIFFEREMTIME牙4S/7,5P005,”P001协CONTRO1BEFFECTSOFDIFFERENTDOSESOFOPNANDFNOILVSMCMIGRATIONS/7,5P005,”P001协CONTRO1CVSMCMIGRATIONHE,2001CULTUREDIN15NCS2TREATEDBYFIN3TREATEDBYOPN图1OPN,FN对VSMC的促迁移作用2OPN,FN对II3整合素表达的影响岛整合素是介导OPN和FN与VSMC相互作用的跨膜信号转导分子WESTERN印迹分析显示,从对照组VSMC中可检测到岛整合素的存在在被OPN,FN处理的VSMC中,岛整合素含量明显升高,两种ECM蛋白相比,OPN对整合素诱导表达的作用大于FN图2,与OPN促迁移作用相一致3OPN,FN对FAK表达活性的影响如图3所示,未经OPN,FN处理的VSMC,其FAK基因转录活性较低,难于测及而在用OPN,FN2OMS/L刺激3,6,12,24H的VSMC中,均可检测到较高水平的FAKMRNA但未观察到明显的时间效应A130KD947KDCONTROLFNOPNBFIG2WESTERNBLOTANALYSISOF岛INTEGRININVSMCSTIMULATEDBYOPNANDFINAIMMUNOBLOTILAGBDENSITOMTERIESCANNING图2OPN,FN处理VSAVLC后整合素WESTERN印迹分析OOOOOOO加吣们加一日3C0L】岛一苫嘀3L0C0LS器IDX3一_CONTROLFNOPNGAPDHA口3HI16H皿12H囝24HFIG3RTPCR0FAKMRNAINVSMCSTIMULATEDBYOPNANDFNARTPCRPRODUCTSOIL8PAGEBDEMITOMETRIC8CAILNG图3OPN,FN处理VSMC后FAKMRNA的表达4O,FN对GAX表达活性的影响GAX是由静止的VSMC所表达的一种同源异型转录因子,通过抑制细胞生长和促进分化对VSMC的增殖和迁移起调节作用图4显示,OPN和FN均可抑制GAX基因表达,两者作用于细胞12H后,GAXMRNA水平显着降低,24H恢复接近至正常水平可见,两种ECM蛋白引起的GAX表达下调具有时间依赖性,其中OPN下调GAX表达的作用大于FNCONTROLFNOPNGAPDHA1薹口3H一口6T皿L2橱BHHFIG4RTPCROFGAXMRNAINVSMCSTIMULATEDBYOPNANDFNARTPCRPRODUCTSOIL8PAGEBDEMITOMETRIC8CAILNG图4OPN,FN处理VSMC后GAXMRNA的表达讨论OPN,FN是合成型VSMC合成并分泌的ECM蛋白,其分子结构中含有RGDARGGLYASP三肽序列,在介导细胞粘附,迁移方面两者具有相似的作用【本实验证实,OPN,FN均可显着诱导VSMC迁移,两者的作用具有时间依赖性和剂量依赖性与生长因子如B不同,OPN,FN促细胞增殖的活性较弱结果未显示165合成和分泌大量的ECM蛋白是合成型VSMC是一个重要特征,也是VSMC赖以增殖和迁移的基础VSMC通过与ECM蛋白的相互作用,而得以在基质中”游走”和”锚定”VSMC与ECM之间的相互作用由整合素所介导已经证明,整合素是由A和B亚基组成的异源二聚体跨膜受体,虽然L7种不同的A亚基和8种不同的B亚基可以组合成20多种不同的整合素L5J,但OPN和FN与VSMC的相互作用主要是由FI3整合素所介导,后者习惯上称为FI3整合素,该整合素在介导VSMC粘附和迁移方面具有重要作用L6J本研究显示,OPN,FN都可诱导FI3整合素的表达,FI3整合素表达水平与VSMC迁移活性相一致尽管OPN和FN同属粘附分子,但从其对细胞迁移的影响来看,前者的作用大于后者,这可能与OPN明显上调FI3整合素表达有关与其他类型的受体不同,整合素本身不具有激酶活性,其对细胞生物学行为的调节是通过粘着斑形成来实现的粘着斑是由聚集的整合素与细胞骨架蛋白结合构成的信号传递复合物FAK在调节粘着斑复合物的组装及活化下游信号分子方面具有重要的作用L7J活化的FAK通过催化细胞骨架蛋白分子上的酪氨酸磷酸化而引发细胞的变形,收缩和迁移L8JFAK活性的调节主要发生在翻译后阶段然而,我们发现,低血清15NCS培养的VSMC中FAK基因低表达,用OPN和FN处理的VSMC,可出现FAK基因转录活性升高提示FI3整合素,一FAK是介导OPN和FN与VSMC相互作用并引发细胞迁移的信号转导途径之一OPN和FN不仅可上调与细胞迁移相关的信号分子表达,同时又可降低细胞增殖和迁移负性调节基因GAX的表达活性有研究显示,GAX在静止的VSMC中高表达,作为细胞增殖和迁移的负调控因子,其作用机制与抑制FI3整合素表达有关【9L这或许是OPN上调FI3整合素表达的重要原因关于ECM蛋白影响GAX和FI3整合素表达的分子机制及FI3整合素在协调VSMC迁移和增殖中的作用,尚待进一步研究参考文献】1CLARKEA,BRAGGEJSINTEGRIN8ANDSIS,TMNSDUETIONPATHWAYSTHEROADTAKEILJSCIENCE,1995,26852082332392韩梅,温进坤,李相印,等不同时相血管平滑肌细胞簟3456L66受促分裂原刺激后基因表达谱及迁移活性的比较J中国生物化学与分子生物学报,2OO0,166809813韩梅,温进坤细胞因子对血管平滑肌细胞MMP一2基因表达的诱导及其作用机制研究J,中国生物化学与分子生物学报,2000,162249253LIAWL,ALMEI也M,HARTCE,ETA1OSTEOPONFINPROMOTESVASCULARCEILADHESIONANDSPREADINGANDISCHEMOTACTICFORNOOTHMUSCLECELLSIN,AROJ,CIRCRES,1994,742214224,GIANCOTTIFG,RUOSLAHTIE,INTEGRINSIGNALING【J】SCIENCE,1999,285543010281032HAWL,SKINNERMP,RAINESEW,ETAL,THEADHESIVEANDMIGRATORYEFFECTSOFUSTEOPONFICAIEMEDIATEDVIADISTINCTEE1SURFACEINTEGRINSJJCLININVEST,1995,952713一79724MORLAAO,MOOGFORDJECONNOLOFSMOOTHMUSCLECELLPROLIFERATIONANDPHENOTYPEBYINTEGRINSIGNALINGTHROUGHFOCALADHESIONKINASEJBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2OOO,2722298302HASSIDA,HUANGSL,YANJ,ROLEOFP】PLBINAORTICSMOOTHMSUCLECELLMOTILITYANDTYRUSINEPHOSPHORYLAFIONOFFOCALADHESIONPROTEINSJ,AMJPHYSIOL,1999,27746H192一H199WITZENBICHLERB,KUREISHIY,LUOZY,ETA1REGULATIONOFSMOOTHMUSCLECELLIMGRAFIONANDIMENEXPRESSIONBYTHEGAXTRANSCIPFIONFACTORJJCLININVEST,1999,104101469一】铝0THERELATIONSHIPBETWEENEXPRESSIONOFIL3INTEGRIN,FOCALADHESIONKINASEANDMIGRATIONOFVASCULARSMOOTHMUSCLECELLSSTIMULATEDBYEXTRACELLULARMATRIXLIUZHIMIN,HANMEI,WENJINKUNINSTITUTEOFBASICMEDICALSCIENCE,HEBEIMEDICALUNIVERSITY,SHIIAZHUANG050017,CHINA【ABSTRACTJAIM,TOSTUDYTHERELATIOMHIPBETWEENEXPRESSIONOF岛INTEGRIN,FOCALADHESIONKINASEFAKANDMIGR