恶性疟原虫感染易致染色体组不稳定和活化诱导胞苷脱氨酶依赖的b细胞淋巴瘤

本科生文献翻译本文出自CELL162,727737,AUGUST13,20152015ELSEVIERINCPLASMODIUMINFECTIONPROMOTESGENOMICINSTABILITYANDAIDDEPENDENTBCELLLYMPHOMA恶性疟原虫感染易致染色体组不稳定和活化诱导胞苷脱氨酶依赖的B细胞淋巴瘤【说明由于本文图表中的内容对理解整个实验有重要作用，因此将图表的内容一同翻译】简图摘要简介恶性疟原虫所致慢性感染引起分布普遍的染色体组不稳定性，并使活化诱导胞苷脱氨酶在GCGERMINALCENTERS，生发中心B细胞中的持续表达从而促成成熟B细胞瘤，这可能解释了疟疾和BURKITT淋巴瘤病发之间的联系。重点对体内生发中心的B细胞染色体易位的捕捉活化诱导胞苷脱氨酶促进了恶性疟原虫相关的B细胞淋巴瘤慢性感染导致了向成熟淋巴瘤表型的偏移恶性疟原虫引发的淋巴瘤存在染色体易位现象其中包括CMYC/IGH融合基因摘要50多年前，在流行病学上恶性疟原虫所致慢性感染曾与地方性BURKITT淋巴瘤相关联，后者是一种成熟的B细胞瘤，以CMYC致癌基因和LGH基因之间的易位为特点。感染是否促进了B细胞瘤、如果如此它的机制一直都不得而知。为了研究寄生虫病与淋巴瘤生成之间的关系，我们使用了夏氏鼠疟原虫PC在鼠体内产生慢性疟感染。夏氏鼠疟原虫延缓了鼠生发中心的扩增，B细胞在独有的发育区内经历了迅速的克隆增殖并表达了活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶AID，形成了一个DNA增变细胞群。GCB细胞在PC感染的过程中发生了普遍的DNA破坏，从而导致了染色体的易位。即使感染没有改变总体突变率，但是它修饰了淋巴瘤的生成从而促成了AID依赖的成熟B细胞淋巴瘤的发生并且显示了染色体的易位。因此，疟疾感染通过诱导AID在GCB细胞中的持续表达促成了成熟B细胞瘤的发生。介绍许多病原体和人类肿瘤的发病都有病因上的牵连，例如，感染EB病毒又称人类疱疹病毒4型、丙肝病毒、HIV、幽门螺杆菌或者恶性疟原虫的个体罹患B细胞淋巴瘤的风险都比平均水平要高。虽然病毒对瘤形成有着直接的促进作用，这一作用是通过向靶细胞传递病毒编码的癌基因来实现的，但是大多数的病原体和肿瘤发生之间的关联依旧模糊不清。比如，地方性的BURKITT淋巴瘤是一种与生发中心相关的淋巴瘤，在非洲是最常见的儿童恶性肿瘤，而且该病在恶性疟原虫感染地区的发病率更高。这种流行病学的关联在很大程度上没有被重视，因为地方性BURKITT淋巴瘤细胞感染的是能使B细胞肿瘤病变的EB病毒，而人们很少去重视疟疾在其中的附加作用。基于组织学、分子学和基因表达分析的方法，人们提出B细胞淋巴瘤细胞就是携带有T814易位染色体的永生化的GCB细胞。这种易位将CMYC基因整合到了免疫球蛋白的基因座上从而使CMYC基因的表达不受控制。不过不受控制的CMYC基因不能单独导致淋巴瘤，它需要编码蛋白质的基因同时受到损伤，这类基因比如调节细胞周期检查点和控制细胞凋亡的P53基因。不论是P53基因突变还是EBV感染都是EBL的特征，它们广泛的出现在淋巴的恶性病变当中。而疟疾与EBL的联系异常紧密。GCB细胞是分裂旺盛的细胞，它们能独特的表达高水平的AID，AID是一种能够诱导DNA突变的酶，它能使胞嘧啶脱去氨基同时在LG基因座上产生错配的UG碱基对从而引发体细胞超突变和抗体的类别转换重组。即使AID对LG基因座有优先的结合作用，但是并不是完全的LG特异性，它能够导致脱靶突变和致癌基因DNA分子的断裂，这其中也包括CMYC基因。AID这种非特异性质能导致体外活化的B细胞的染色体易位，在IL6INTERLEUKIN6，白介素6转基因的小鼠体内导致多克隆的浆细胞增多症。我们将展示在没有P53基因的情况下，PC感染在成熟B细胞淋巴瘤中的作用效果。疟疾能改变淋巴瘤的生成从而促成成熟GC或后GCB细胞淋巴瘤，同时也能破坏快速增殖的AID表达的GCB细胞的基因组稳定性。FIGURE1B细胞对疟原虫感染有应答A和B脾细胞总数，B细胞总数A和生发中心B细胞B，感染之后数目变化。带有标准差的均数如图所示，并且每个点的值来自于至少5只小鼠的数据。CAID的表达仅限于生发中心的B细胞。来自于疟原虫感染的标记AID小鼠的脾细胞利用流式细胞仪计数。最上边的折线展示的是一段时间以内有生发中心绿和无生发中心红的B细胞的相对繁殖数目B220B细胞。最下面的折线展现了非B细胞B220，灰色，非生发中心B细胞B220CD38CD95，红色和生发中心B细胞B220CD38CD95，绿色绿色荧光标记的AID表达情况。每个点的值来自于至少3只小鼠的数据。D疟疾感染生发中心B细胞的AID蛋白。左边的设门策略和右边的半定量的WESTERN分析将接种3周后的细胞分为了亮区LZ细胞和暗区DZ细胞。三角形的区域显示的是3倍的系列稀释。AID/AID敲除的纯合和野生型控制对照组是来自于体外激活的B细胞各自的基因型。两次独立实验的结果之一如图。可见FIGURES1。结果疟原虫感染引发生发中心进行AID表达我们利用PC在鼠体内产生慢性疟疾感染，与早先的报告相同，寄生虫血症在感染开始710天的时候出现高峰，随后出现了脾细胞总量的增多均值大约是2866百万细胞每个脾，在三周内实现了4倍的增殖，包括B淋巴细胞均值为1304百万细胞每个脾，在四周内扩增了3倍；详见FIGURES1AANDS1A。引人注目的是，脾的GCB细胞扩增了63倍之多均值为154百万GCB细胞每个脾，时间是三周，这种状态持续了超过10周FIGURE1B。我们得出的结论是疟原虫感染引发了强大的持续时间长的GCB细胞扩增。IG体细胞突变和类别转换重组是由AID引发的。这种酶被限制在生发中心的活化B细胞内，但是疟疾引发的感染激活了B细胞。为了确定在PC感染当中AID是否被抑制，我们检查了AID纯合的基因报告小鼠，发现AID表达受限于GCB细胞并持续了至少10周的时间FIGURES1CANDS1B。为了证实AID蛋白的表达，我们选取了暗区和亮区的GCB细胞进行了蛋白印迹分析。不出所料，AID主要在暗区发现，这个数字比亮区或者体外活化B细胞当中多3倍FIGURE1D。因此我们得出结论AID在疟原虫感染的GCB细胞中为主要表达。疟疾感染的生发中心存在广泛的染色体易位现象AID和复制相关的复制压力可以独自导致培养B细胞的DNA断裂和染色体易位。为了定位体内疟原虫感染造成的DNA破坏，我们采取了之前描述的下一代捕捉和测序技术TCSEQ。带有CMYC基因ISCEI识别位点的小鼠被我们培育成ROSAERISCEI编码ISCEI以融合雌激素感受器配体结合域转基因小鼠和AID缺乏或者AID过量表达的小鼠ROSAAIDER，见实验流程，FIGURES2。MYCI/IROSAERISCEI/ERISCEIAID/和MYCI/IROSAERISCEI/AIDER小鼠注射了疟原虫并且在GC反应的高峰期用他莫昔芬处理，以在AID或有或无两种情况下，利用TCSEQ技术捕捉处理引起的ERISCEI核穿梭、15号染色体MYCI基因的DNA断裂所致易位和基因组其他位置的损伤。我们在105亿个疟疾感染的AID缺乏或者充足的GCB细胞中分别找回了191150个和65905个MYCI基因ISCEI位点的独特重排见实验流程。与先前的体外试验吻合，重排更容易发生在染色体内所有重排相关的显示分别为952和943，FIGURE2B，并且丰富了ISCEI位点。不管AID有没有表达，重排在基因区的增长显著，超过了预期401的任意分布FIGURE2D，促成了更多活跃的转录基因FIGURE2E。与此一致的是，ISCEI位点中转录方向的不对称分布结果在疟疾生发中心中的展现要比体外模拟的B细胞要少，它表达了更高水平的CMYC基因FIGURES2CANDS2E。我们得出的结论是，有疟原虫体内感染引发的染色体重排的总体分布和体外逆转录感染的细胞相似。与DNA复制脆性位点有关的AID非依赖性的破坏早期复制脆弱位点是一段染色体基因序列，在DNA复制的过程中易于突变的序列。为了估计DNA复制在疟疾导致的重组中的作用，我们分析了ERFSS中的病毒整合位点的出现情况。ERFSS中的一小部分的易位现象在AID存在或者不存在两种情况下是相似的分别是总数的15和2并且极大的丰富了蒙特卡罗统计模拟方法决定的随机分布FIGURE3A。ERFSS的易位更容易在基因区发生，尤其是经常进行转录的基因FIGURES3。相反，在普通脆性位点中并没有被丰富，而普通脆性位点是晚期复制区，更容易在有丝分裂时被破坏FIGURE3B。我们得出的结论是在疟疾引发的GCB细胞DNA损伤更容易出现在ERFSS，不论AID存在与否。AID损伤疟疾感染GCB细胞的染色体组为了确定AID具体破坏了GCB细胞基因组的哪一部分区域，我们利用严格的标准比对了AID缺乏和AID充足的细胞TC序列文库在易位中局部累积的情况，正如之前预想的，在LGH基因座中我们观察到了AID依赖的易位的“热点”，这些累积发生在SM,S2B和S2A等转换区间内FIGURE4ATABLES1。相反的，B细胞AID基因的易位激活了体外形成的热点，尤其是在SM,S1和S3等处FIGURE4A。还有其他15个热点在无LG区间被观察到，在CMYC基因和靠近LY6E基因处AID依赖的突变活性脱靶效应也被证实FIGURES4B,4C,ANDS4ATABLES1。这与之前的研究报告相符，AID基因易位丰富了基因区间并且促成了更多的高转录活性的基因FIGURESS4BANDS4C。更重要的是，在体内没有任何类似体外AID易位脱靶效应被观察到TABLES1。总之，在包括LGH基因座在内的AID依赖的热点处总共只有总量的07。我们得出的结论是AID首先破坏GCB细胞的LG区间，当然也不止会破坏LG区间。AID促成了晚期淋巴瘤除了CMYC基因的激活，B细胞淋巴瘤同时也存在着频繁的P53基因的突变。为了模拟这种现象，我们准备了带有B细胞特异的P53基因缺陷的小鼠CD19CRE/P53LOX/LOX并且非AID充足即AID缺乏的小鼠。P53基因的敲除并没有显著改变小鼠体内B淋巴细胞的生长FIGURES5。为了模仿地方性疟疾地区的慢性暴露的情况，我们进行了两组重复的实验，分别进行PC感染和疾病的模拟。小鼠在AID依赖的模式下进行淋巴瘤发生FIGURE5。疟疾不是淋巴瘤发生的必要条件，但是它改变了表型来促进更多的成熟的B细胞淋巴瘤FIGURE6。11只野生型的小鼠当中没有任何一只在感染之后生病，而P53基因缺乏的两组小鼠全部死亡，CD19CRE/P53LOX/LOX存活天数中位数是60周，CD19CRE/P53LOX/LOXAID/存货天数中位数是58周MANTELCOX检验的P08，FIGURE5A。然而，所有的12只CD19CRE/P53LOX/LOX小鼠都患上淋巴瘤，同时15只CD19CRE/P53LOX/LOXAID/小鼠当中只有5只有淋巴瘤的患病迹象占比33，费舍尔精确检验的P02，FIGURES6A。但是，对比疟疾感染，只有一小部分的羊血红细胞引发的淋巴瘤显示了后GC的表型费舍尔精确检验P95的纯度。将野生型小鼠的静息淋巴细胞和AID/小鼠用免疫磁性的方式、抗CD43微球来自于MILTENYIBIOTECH去除脾脏并在25G/ML的LPS、5NG/ML的IL4的条件下进行4天的培养。这样AID就能够被检测出来。疟疾GCB细胞的纯化和TCSEQ文库的准备在进行疟原虫感染的35周之后，MYCI/IROSAERISCEI/AIDER或MYCI/IROSAERISCEI/ERISCEIAID/小鼠腹膜注射08MG的溶解在玉米油中的他莫昔芬，36小时之后进行安乐死。红细胞裂解之后，脾单细胞悬液在生物素标记的小鼠CD43、CD11C、F4/80、GR1和LGD中冰下孵育20分钟所有材料来自于BDPHARMINGEN或EBIOSCIENCES。在洗涤的时候，细胞与抗生物素的微球孵育，同时在磁性纵列中呈负减少。随后进行抗CD19的微球阳性磁性选择。GCB细胞的纯度由流式细胞计数监控，范围在8895。两个TCSEQ文库的每个基因型都是独立的培养，CMYC基因ISCEI位点的捕获、利用更新的连接体排除5GCAGCGGATAACAATTTCACACAGGACGTACTGTGCGGCCGCT和5/5PHOS/GCGGCCGCACAGTACTTGACTGAGCTTTA/3DDC/。高通量基因组测序在已