【毕业论文】缺氧对维甲酸诱导基因-i介导的抗病毒免疫应答的调控及机制研究

2015届本科生毕业论文（设计）题目缺氧对维甲酸诱导基因I介导的抗病毒免疫应答的调控及机制研究学院系生命科学学院专业年级生物技术113班完成日期2015年6月目录摘要1ABSTRACT2第一章绪论311研究意义312免疫应答简介3121机体免疫应答3122抗病毒免疫信号通路4123重要的细胞因子413缺氧免疫调控研究现状8第二章材料与方法821材料822主要试剂823主要设备和软件924方法9241小鼠腹腔巨噬细胞的分离9242RNA提取9243逆转录反应10244实时定量PCR10245免疫印迹法11246过表达质粒的构建12247酶联免疫吸附测定法13247流式细胞术13248过表达质粒的构建1325技术路线15251体外缺氧抗病毒免疫应答研究15252体内缺氧抗病毒免疫研究15253缺氧抗病毒免疫调控机制研究15第三章结果与讨论1631结果16311缺氧促进流感病毒诱导的细胞因子风暴,增加小鼠死亡率16312缺氧促进巨噬细胞对病毒的免疫应答16313缺氧通过PD1依赖的机制调控RIGI的表达1732讨论19参考文献21致谢23缺氧对维甲酸诱导基因I介导的抗病毒免疫应答的调控及机制研究摘要维甲酸诱导基因（RETINOICACIDINDUCIBLEGENE,RIG）位于细胞质内，识别病毒双链RNA的解旋酶，是抗病毒信号通路的胞内主要受体蛋白，属于RIG样受体（RIGLIKERECEPTORS,RLRS）家族成员。近年来，大量研究证实缺氧是调控机体炎症反应的一个重要因素。虽然没有研究报道缺氧和RIGI信号之间是否存在关联，但体外细胞培养体系中发现缺氧显著抑制流感病毒感染和扩增效率。本实验研究缺氧对维甲酸诱导基因I介导的抗病毒免疫应答的调控及机制。在缺氧条件下利用HINI感染小鼠发现缺氧促进流感病毒诱导的细胞因子，增加小鼠死亡率。体外H1N1流感病毒刺激，QPCR和ELISA检测发现缺氧促进巨噬细胞对病毒的固有免疫应答。分别利用RNA干扰技术和分子克隆技术，检测PD1下调和过表达状态下细胞因子的表达变化,发现细胞因子的表达与PD1呈负相关。H1N1刺激转染PD1SIRNA的RAW2647，WESTERNBLOT检测不同时间点相关蛋白水平发现，相比于常氧对照组，低氧培养的巨噬细胞刺激后表达更低水平PSHP2和更高水平的RIG蛋白。实验结果表明缺氧可以促进病毒感染后巨噬细胞的固有免疫应答并通过PD1依赖的机制调控RIG的表达。关键字缺氧维甲酸诱导基因；免疫应答；程序性死亡受体1THEROLEOFHYPOXIAINREGULATINGRIGMEDIATEDANTIVIRALRESPONSEAUTHORHUANLELITUTORYANGLIUCOLLEGEOFLIFESCIENCESNORTHWESTARIGIMMUNERESPONSEPD1第一章绪论11研究意义病原微生物感染是人类健康最大的威胁，而固有免疫是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线。流感病毒属于正黏液病毒科单股负链RNA病毒，可感染所有年龄人群，易发生变异从而造成疫情的大面积爆发1。自上世纪以来，有记录的流感大流行就有7次，仅2009年甲型H1N1流感疫情就造成全球29万患者死亡，对人类的生存和健康构成重大威胁2,3。近年来我国流感疫情爆发频繁，除季节性流感外，多地还出现甲型H1N1、H5N1、H7N9、H10N8人感染病例。其中2013年3月在我国首次发现新亚型H7N9禽流感病毒，不仅可以感染人类，且致病力强，患者病情发展迅速，常快速进展为急性呼吸窘迫综合症、严重低血氧症、感染性休克，甚至多器官功能衰竭，病死率很高4,5。当前研究发现，除了病毒感染直接造成的组织细胞损伤外，机体固有免疫系统，巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞等，对病毒过度应答，造成体内多种炎症因子的大量聚集，即“细胞因子风暴”（CYTOKINESTORM所造成组织损伤、多器官衰竭是流感病毒感染患者高病死率的重要病理机制之一68。深入研究机体内“细胞因子风暴”形成和调控机制有重大的临床意义。12免疫应答简介121机体免疫应答免疫应答是指机体受抗原刺激后，体内抗原特异性淋巴细胞识别抗原，发生活化、增殖、分化或无能、凋亡，进而表现出一定生物学效应的全过程。淋巴细胞对抗原的特异性识别能力受遗传基因控制，并在个体发育过程中形成。免疫应答最基本的意义是识别“自己”与“非己”从而清除“非己”的抗原性物质，保护机体免受异己抗原的侵袭。“免疫应答IMMUNEREACTION”主要指免疫应答过程中产生抗体和致敏淋巴细胞与抗原特异性结合所发生的反应。免疫应答的类型主要取决于抗原的质和量，以及机体的免疫状态和反应性。正常情况下，机体对抗原产生生理性免疫应答（免疫保护）对“非己”抗原产生正应答，以抵御外源性抗原的侵害；对自身抗原产生负应答（即免疫耐受），以保护自身组织不受免疫攻击而被损伤。异常情况下，机体对抗原刺激产生病理性免疫应答（免疫损伤）对“非己”抗原产生过高应答导致超敏反应，或过低应答导致免疫功能低下或缺失，从而引发严重感染或肿瘤；机体弱队自身抗原产生正应答，则导致自身免疫病。适应性免疫应答的物质基础是免疫细胞。免疫细胞在中枢免疫器官经历阳性选择和阴性选择，获得MHC限制性识别能力，并清除自身反应性淋巴细胞克隆或使其失能，成熟的淋巴细胞则迁移至外周免疫器官。外周免疫器官（主要是淋巴结和脾脏）是发生免疫应答的主要场所。在外周免疫器官内，免疫细胞（主要是抗原提呈细胞和淋巴细胞）间发生极为复杂的相互作用并彼此协作。免疫应答的过程十分复杂，对其基本规律已有一定了解，但某些具体环节尚未完全清楚。免疫应答是在遗传调控下，有多重免疫细胞和免疫分子的参与而发生。一般将免疫应答过程划分成为紧密相关切不可分割的若干阶段。1感应（识别）阶段抗原被APC摄取、加工、处理；T细胞/B细胞通过TCR/BCR特异性识别抗原肽。2增殖和分化阶段T/B细胞特异性识别抗原，产生其激活的第一信号；T/B细胞与APC表面多种黏附分子相互作用，提供T细胞激活的第二信号（即共刺激信号）。另外，激活的APC与T细胞所产生的多种淋巴因子被视为第三信号，它们通过自分泌和旁分泌作用，参与淋巴细胞增殖和分化，最终形成效应性T细胞或浆细胞。3效应阶段免疫效应细胞和效应分子（细胞因子和抗体）共同发挥作用，清除非己抗原或诱导免疫耐受，从而维持机体正常生理状态，或引发免疫相关性疾病。4恢复阶段由于病原体被清除，活化增值的淋巴细胞克隆通过被动性死亡及活化诱导的细胞死亡机制而发生凋亡，免疫系统恢复平衡，同时，由于体内已形成长寿命的抗原特异性记忆淋巴细胞，一旦相同抗原再次入侵，记忆淋巴细胞可迅速产生比初次应答更为有效的应答。根据参与免疫应答和介导免疫效应的组分及细胞种类的不同，适应性免疫应答可分为T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫。122抗病毒免疫信号通路机体的天然免疫系统在抵抗病毒感染方面发挥着重要作用。病毒感染宿主细胞后，宿主细胞可以通过模式识别受体PATTERNRECOGNITIONRECEPTORS，PRR侦测病原相关分子模式PATHOGENASSOCIATEDMOLECULARPATTERNS，PAMP的存在，从而激活宿主的天然免疫反应，诱导干扰素IFN、促炎症细胞因子等一系列抗病毒因子的产生。TOLL样受体TOLLLIKERECEPTOR，TLR家族是一类重要的PRR，在RNA病毒的识别过程中发挥重要作用，如TLR3识别DSRNA；TLR7和TLR8识别SSRNA等。但由于TLR家族成员均为跨膜蛋白，只能识别细胞外或内体中的RNA病毒，对于细胞质中的RNA病毒，TLR则无法做出反应。RIGI样受体RIGILIKERECEPTOR，RLR是一类新发现的PRR，能够识别细胞质中的病毒RNA，诱导干扰素和促炎症细胞因子的产生，对抗病毒天然免疫的建立起着至关重要的作用。当前研究发现流感病毒可被多种模式识别受体（PATTERNRECOGNITIONRECEPTORS,PPRS）识别，激发机体固有免疫应9，包括RLRSRIGILIKERECEPTORS家族的维甲酸诱导基因IRETINOICACIDINDUCIBLEGENEI,RIGI、TLRSTOLLLIKERECEPTORS家族的TOLL样受体3和7（TLR3和TLR7）以及NLRSNODLIKERECEPTORS家族的NLRP310,11。哺乳动物体内还有其它一些固有抗病毒分子INTRINSICANTIVIRALFACTORS，其中IFIFM和IFIT家族分子可通过阻止流感病毒进入胞内、抑制病毒基因转录和翻译等机制发挥抗流感病毒的作用12。123重要的细胞因子1231干扰素干扰素是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白。干扰素在整体上不是均一的分子，可根据产生细胞分为3种类型白细胞产生的为型；成纤维细胞产生的为型；T细胞产生的为型。根据干扰素的产生细胞、受体和活性等综合因素将其分为2种类型型和型。型干扰素又称为抗病毒干扰素，其生物活性以抗病毒为主。型干扰素有3种形式IFN、IFN和IFN。IFN主要由白细胞产生，含有至少14种不同基因编码的蛋白质，各成分之间氨基酸顺序的同源性约为90，成熟的IFN的分子量约1820KD。IFN是单一基因的产物，主要由成纤维细胞和白细胞以外的其他细胞产生；分子量20KD，与IFN的同源性在氨基酸水平上仅为30，在核苷酸水平上约45。IFN的基因有6个，但其中只有1个是有功能的；IFN与IFN的基因相近，而且其主要产生细胞也为白细胞。IFN、和的受体为同一种分子，其基因位于第21号染色体上，表达在几乎所有类型的有核细胞表面，因此其作用范围十分广泛。多数型干扰素对酸稳定，在PH20时不被破坏。型干扰素又称免疫干扰素或IFN，主工由T细胞产生；主要活性是参与免疫调节，是体内重要的免疫调节因子。IFN与型干扰素几乎在所有方向均有不同IFN只有一种活性形式的蛋白质，由一条分子量为18KD的多肽链进行不同程度的糖基化修饰而成；IFN的基因只有一个，位于人类第12号染色体上；IFN的受体与型干扰素的受体无关，其基因位于第6号染色体上，但也同样表达在多数有核细胞表面；IFN对酸不稳定，在PH20时极易破坏，利用此特性可以很容易地将其与型干扰素区分开来。正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素的作用下才能诱使细胞产生干扰素。型干扰素的主要诱生剂是病毒及人工合成的双链RNA，此外某些细菌和原虫感染及某些细胞因子也能诱导型干扰素的产生。IFN和的表达细胞非常局限，以白细胞为主；但IFN则可由几乎所有的有核细胞产生。IFN由CD8T细胞和某些CD4T细胞（特别是TH1细胞）产生，NK细胞亦可合成少量的IFN；这些细胞只有在免疫应答中受到抗原或丝裂原活化后才能分泌IFN。干扰素的生物活性有较严格的种属特异性，即某一种属细胞产生的干扰素，只能作用于相同种属的细胞。型干扰素的抗病毒作用较强，而型干扰素则具有较强的抑制肿瘤细胞增殖和免疫调节作用。目前，国内外均已利用基因工程技术批量生产重组人IFN、IFN、IFN，并投入抗病毒和肿瘤治疗的临床研究。抗病毒作用型干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但这种效应不是直接的，而是通过对宿主细胞的作用引起的13。对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体，核内有“抗病毒蛋白”基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻止病毒MRNA翻译，并促进病毒MRNA降解。干扰素能提高细胞表面MHC类分子的表达水平，受到病毒感染的细胞表面MHC类分子的增加有助于向TC细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解。干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。抗肿瘤作用型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞的有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强5001000倍。另外，型干扰素也可通过增强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其抗肿瘤效应。干扰素的免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用14。（1）对巨噬细胞的作用IFN可使巨噬细胞表面MHC类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达FC受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。（2）对淋巴细胞的作用干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFN对B细胞和CD8T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFN能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFN不仅抑制TH2细胞产生IL4，而且抑制IL4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IGE。（3）对其它细胞的作用IFN对其他细胞也有广泛影响刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；活化NK细胞，增强其细胞毒作用；使某些正常不表达MHC类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHC类分子，发挥抗原递呈作用；使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。1232白细胞介素6IL6产生IL6的细胞主要有单核/巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、角质细胞、T细胞（主要是TH2）和B细胞等。可能由于由于其糖基化和磷酸化不同，单核细胞至少表达5种不同分子量的IL6。IL64缺少第四个外显子，可与IL6RA链结合为复合物，但不能传递信号从而竞争性抑制IL6的生物活性。IL6由配体结合的链（CD126）和信号传递链（GP130，CD130）组成，后者无配体结合能力，但参与组成IL6高亲和力结合位点，且是LIFR、OSMR、CNTFR、IL11R和CT1R的公用信号传递链。IL6R广泛表达于活化B细胞、静止T细胞、NK细胞骨髓瘤细胞肝细胞髓样白血病细胞等表面。SIL6R能与IL6形成复合物，进一步结合GP130，发挥IL6的生物学作用15。IL6是多功能炎性细胞因子，是炎性介质网络的关键成份，在炎症反应中起重要作用。作为抗炎症细胞因子或远期细胞因子可平衡前炎症细胞因子或早期细胞因子的损伤效应，起到一定的保护作用。IL6可以通过抑制巨噬细胞产生IL1和肿瘤坏死因子而在细菌内毒素诱导的实验性肺损伤中起细胞保护和抗炎作用。由于具有致炎和抗炎的双向功能，它的作用与组织中的含量有关，正常水平对机体有利，产生过多会引起一系列炎性损害。体内IL6的水平上升，可以导致多种疾病如类风湿性关节炎、肾小球肾炎的肾小球增殖，克罗恩病CD和CASTLEMAN氏病等。有研究表明16，在炎症、感染和患有某些肿瘤等情况下，血清中IL6的含量会有不同程度上升，因此IL6水平可作为判别病情严重程度的灵敏指标并可藉此判断患者的预后。1233肿瘤坏死因子人TNF有两种分子形式，一种称为TNF，另一种称为TNF。TNF由细菌脂多糖活化的单核巨噬细胞产生，可引起肿瘤组织出血坏死，也称恶病质素（CACHECTIN）；TNF由抗原或丝裂原刺激的淋巴细胞产生，具有肿瘤杀伤及免疫调节功能，又称淋巴毒素（LYMPHOTOXIN，LT）。尽管两型TNF有不同的细胞来源，DNA水平上也仅有28的核苷酸序列同源，但两者结合于相同的膜受体，并且具有非常相似的生物学功能。人TNF和的基因均位于第6号染色体。成熟TNF的分子量约17KD，而TNF略呈异质性，为2025KD。TNF受体存在于几乎所有的有核细胞表面，目前已发现两种TNF受体（TNFR和TNFR）17。TNFR的亲和力比较强，TNFR的亲和力相对弱一些。两者与TNF结合后产生的效应有所不同，TNFR主要增强细胞毒细胞的活性和促进成纤维细胞生长，击TNFR主要是增进T细胞增殖。最初对TNF功能的认识仅限于对肿瘤的特异性杀伤作用，后来发现TNF也具有免疫调节作用，而且参与某些炎症反应的过程。TNF的生物活性与IL1十分相似，只是TNF的毒性较大，更易引起血管阻塞，抗肿瘤作用更强。低浓度的TNF主要在局部发挥作用，高浓度的TNF可以进入血流，引起全身性反应。近来的研究表明人和小鼠TNF和的基因都与MHC基因紧密连锁，暗示其可能参与免疫调节基因的表达调控。抗肿瘤及抑瘤作用TNF对多种肿瘤细胞均有杀伤或抑制作用，敏感性因肿瘤细胞类型而异。TNF抗瘤机制尚不完全清楚，可能包括18通过TNF受体介导的直接效应；诱导组织内凝血活性，导致病理性凝血，阻断进入瘤区的血流；诱导肿瘤局部的炎症反应及血管改变；介导多种细胞的杀瘤性效应，如自然细胞毒细胞（NC）、杀瘤性单核巨噬细胞等。抗病毒作用TNF呈剂量依赖性地抑制病毒介导的细胞病变的发展，对RNA病毒和DNA病毒均有抑制作用。TNF的抗病毒活性与抗瘤活性一样没有明显的种属特异性，抗病毒的机制19不是通过诱导干扰素的间接作用，与TNF的细胞毒性也无直接关系。除诱导未感染细胞有抗病毒能力之外，TNF也可选择性杀伤病毒感染的细胞。现还证实，多种病毒、POLYC等也可刺激TNF的产生。免疫调节作用TNF能够增强T细胞产生以IL2为主的淋巴因子，提高IL2R的表达水平，从而促进T细胞的增殖；还能促进B细胞增殖、分化和产生抗体。此外，TNF能诱导单核巨噬细胞系统的前体细胞分化，增加其吞噬能力和氧化代谢水平，扩大单核巨噬细胞对肿瘤的ADCC效应，提高巨噬细胞的抗原递呈能力；TNF可增加某些细胞的MHC类分子的表达，协同IFN诱导MHC类分子的表达；近来还发现TNF可促进骨髓基质细胞和巨噬细胞产生CSF，特别是GMCSF，可促使骨髓释放中性粒细胞和巨噬细胞。诱发炎症反应TNF有中性粒细胞和单核细胞趋化作用，并使之活化和脱颗粒，释放炎症介质19。TNF作用于血管内皮细胞，一方面提高粘附分子的表达水平，促进对中性粒细胞的粘附作用；一方面诱使血管内细胞产生其它炎症介质，如PG、IL6和IL8等，与白细胞产生的介质共同引起局部的炎症反应；活化的血管内皮细胞还可释放凝血第三因子，启动凝血过程，引起小血管阻塞，造成局部组织（如肿瘤组织）血液供给中断和出血坏死，这是TNF得以被发现的主要特征。细菌内毒素休克时发生的弥漫性血管凝血（DIC）即是由于大量的TNF产生和释放人血所致。此外，TNF还可诱导肝细胞合成急性期反应蛋白，是IL1之外又一个急性期反应的强力诱导剂。1234PD1受体蛋白早在1992年，ISHIDA等人20首次分离出PD1基因并命名。PD1是一个55KDA的型跨膜表面受体蛋白，胞外区为免疫球蛋白样IGV区。PD1分子最显著的特征是胞浆区的尾部含有两个酪氨酸残基，N末端酪氨酸残基参与构成一个免疫受体酪氨酸抑制基序（IMMUNORECEPTORTYROSINEBASEDINHIBITORYMOTIF,ITIM）,C末端酪氨酸残基则参与构成一个免疫受体酪氨酸转换基序（IMMUNORECEPTORTYROSINEBASEDSWITCHMOTIF,ITSM），其中后者在PD1介导的负性调节中起着关键的作用。与CD28家族其他受体不同的是，其他成员胞外部分都是二硫键连接的同源二聚体，而PD1是单体结构；此外，PD1胞外部分的CDR3没有XXPPP（F/Y）序列（X代表任意氨基酸），而这个序列对于CD28家族其他成员的配体结合功能是关键性的21,22。小鼠PD1由其1号染色体PDCD1基因编码，人类PDCD1基因定位于2Q37323。人和小鼠PD1的核苷酸序列具有70的同源性，都编码一个288个氨基酸残基组成的蛋白质，并且在氨基酸水平上有60的同源性。TSUDA等24发现呼吸道上皮细胞可持续性表达PDL1和PDL2，病毒感染后，病毒DSRNA和聚肌苷酸胞苷酸类似物能刺激其表达水平的上调。IFN、IL13和T细胞培养上清也有同样作用，提示呼吸道上皮细胞中的PDL1和PDL2在呼吸道病毒感染的免疫反应中有一定的作用。PD1PDL途径调节着有效对抗外来侵袭以及自身免疫反应之间的平衡。如研究人员在PD1缺陷小鼠中观察到它们能够迅速清除感染机体的腺病毒，但与此同时也发生了较野生型小鼠更为严重的肝损伤25。JUN等26构建小鼠单纯疱疹性角膜炎模型，应用PDL1单抗后，单纯疱疹病毒1特异性的CD4T细胞数量增加，分泌IFN增加，小鼠角膜炎病情加重。这些研究说明了在病毒感染过程中，PD1PDL途径可以抑制病原特异性T细胞对机体自身的杀伤作用。13缺氧免疫调控研究现状流感病毒侵犯呼吸道上皮细胞，尤其是H5N1和H7N9等亚型更可直接侵犯下呼吸道和肺泡上皮细胞，导致重症肺炎，严重影响肺部通气功能，造成组织缺氧和低血氧症。因此在流感病毒感染的情况下，体内的固有免疫细胞，尤其是肺泡和呼吸道浸润的固有免疫细胞是在低氧分压（HYPOXIA,缺氧）的环境中识别病毒RNA并产生应答27。早在1936年，MAGILL等就已经发现在体外细胞培养体系中，缺氧显著抑制流感病毒感染和扩增效率；1952年KALTER等也发现缺氧抑制流感病毒在小鼠体内的复制,提示缺氧可以提高机体的抗病毒能力，但是迄今其具体机制尚未探明28，更重要的是，临床上重症呼吸道病毒感染患者常并发低氧血症和“细胞因子风暴”，但它们之间是否存在关联尚未可知。综上所述，研究缺氧是否上调固有免疫细胞对病毒的应答及其可能的分子机制对于解析重症呼吸道病毒感染患者体内伴发的细胞因子风暴的形成机制，及有效的治疗方案的建立具有重要意义。第二章材料与方法21材料实验动物C57BL/6J小鼠，68周龄，浙江大学医学院动物实验中心饲养。实验用细胞系小鼠巨噬细胞系RAW2647实验室常规保存。分子克隆实验相关试剂大肠杆菌感受态菌株DH5A实验室常规保存。琼脂糖DNA回收试剂盒购自AXYGEN。质粒小量提取纯化试剂盒购自AXYGEN。细胞总RNA抽提试剂TRIZOL购自LIFETECHNOLOGIES。TAQDNA聚合酶，LIGATIONHIGH高效DNA连接酶购自TOYOBO。PRIMERSTAR聚合酶和本实验用限制性内切酶购自TAKARA。本实验用引物为上海生物工程有限公司合成。PCDNA31BHA质粒、LUCNFB、LUCIRF3质粒、TA克隆质粒实验室常规保存。22主要试剂1PBS缓冲液PHOSPHATEBUFFEREDSALINE,PBS1L79GNACL,02GKCL,024GKH2PO4，18GK2HPO4。HCL调溶液PH值至7274。2DMEM高糖培养基，RPMI1640，胎牛血清、巯基乙醇（2MERCAPTOETHANOL）、胰酶购自GIBCO公司。3TLR2激动剂肽聚糖PGN、TLR3激动剤POLYIC、TLR4激动剂LPS购买自INVIVOGEN公司。4干扰SIRNA以及空白对照购买自上海吉玛制药技术有限公司。5转染用试剂JETPEI、JETSIENDO、INTERFERIN购买自PLUSTRANSFECTION公司。6RNA逆转录试剂盒，实时荧光定量PCR检测试剂盒SYBRPREMIXEXTAQTMPERFECTREALTIME购买自TAKARA。7小鼠IL6、TNFA、IFN的ELISA试剂盒购买于EBIOSCIENCE公司。23主要设备和软件采用PRIMERPREMIER50引物设计。APPLIEDBIOSYSTEMS7500REALTIMEPCR系统。数据分析软件为GRAPHPADPRISM5。BIORADPCR仪。THERMO常温离心机、冷冻离心机。TS1型摇床。THERMOST40R型离心机。OLYMPUSCKX31型显微镜。BIORAD电泳仪。THERMONANODROP2000光谱仪。BIORAD凝胶成像系统。BIORADMODEL680酶标仪。ROWSONPSH200生化培养箱。海尔细胞超净工作台。AIRTECH细菌台。SANYOCO2恒温细胞培养箱。BDFACSCALIBUR流式细胞仪24方法241小鼠腹腔巨噬细胞的分离1将3的脱水硫羟乙酸培养基2ML/只，酒精消毒后，在后肢附近处，用1ML注射器注入小鼠腹腔，注射3天后收集腹腔细胞。2将小鼠用颈推脱臼法处死，后75酒精浸泡3分钟。3将小鼠表面酒精用镊子捋干后放入培养皿中，腹面向上。4用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，用镊子撕开皮肤，完全暴露腹膜。用20ML注射器轻刺入腹腔内，注入10ML无血清培养基，针尖朝上，注意避开肠和脂肪，后回抽，朝不同方向反复吹打抽吸腹腔三次，后吸出腹腔液。5将收集的腹腔液放入离心管，于1000RPM离心5分钟。6用含有10FBS的RPMI1640重悬。观察若存在红细胞，用红细胞裂解液裂解红细胞。7将细胞悬液置入培养板，于细胞培养箱培养2小时后，弃去上清。再用预热好的培养基洗一次。培养皿留下的贴壁细胞为新鲜分离的小鼠腹腔原代巨噬细胞。242RNA提取1将RAW2647用培养基吹打后收集到EP管中，300G离心5分钟，倒掉上清，加1MLPBS后300G离心5分钟。倒掉上清，后加入1MLTRIZOL,2加入200L的氯仿，剧烈震荡涡旋使其充分混匀；3室温下静置10分钟。4在低温高速离心机中4，12000G，离心15分钟；5离心后液体分为三层，吸取上层液体400L于RNAFREE的EP管中，加入400L异丙醇。上下颠倒六至七次混匀。6室温放置20分钟后4，12000G，离心15分钟。小心地弃去上清。7加入1ML75乙醇（DEPC水配制），4，12000G，离心5分钟，小心地弃去上清。8再加入1ML无水乙醇于4，12000G，离心5分钟。小心的弃去上清。室温下干燥使乙醇完全挥发后，将RNA溶解于适量的DEPC水。9RNA浓度和纯度测定（NANODROP2000）,后保存于80待用。243逆转录反应将上步骤提取的RNA放65，5MIN，打开二级结构后冰冷2MIN以上行逆转录反应。逆转录体系如下5PRIMESCRIPTBUFFER2ULPRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI05ULOLIGODTPRIMER1LDNTP10MM1LRNA1000NGDEPCH2O补全至10L3715小时后，9810分钟，放负20度保存，用于实时荧光定量PCR分析。244实时定量PCR上步骤合成的CDNA可做荧光定量PCR的反应模板，分别用相应的荧光定量PCR引物，进行定量PCR扩增。定量PCR体系为10LSYBRMIX5LCDNA模板100NG上下游引物05LDDH2O补全至10L小鼠ACTIN荧光定量引物上游CTGTCGAGTCGCGTCCACC下游CGCAGCGATATCGTCATCCA小鼠IFN荧光定量引物上游ACCTACAGGGCGGACTTCAA下游GTCTCATTCCACCCAGTGCT小鼠IL6荧光定量引物上游CACTTCACAAGTCGGAGGCT下游CTGCAAGTGCATCATCGTTGT小鼠TNF荧光定量引物上游GATCGGTCCCCAAAGGGATG下游TTTGCTACGACGTGGGCTAC后采用两步法PCR扩增标准程序。步骤1预变性9530秒步骤2PCR反应955秒6030秒步骤3解离245免疫印迹法1蛋白样品制备1倒掉培养液，并将残余培养液流到皿底然后再用移液器将其吸走每孔细胞加2MLPBS。平放轻轻摇动1MIN洗涤细胞，然后弃去洗液。2每孔细胞加含PMSF的裂解液500L，于冰上裂解10MIN。3裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于孔板的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至15ML离心管中整个操作尽量在冰上进行，于4下14000G离心15MIN。4将离心后的上清分装转移到新的离心管中，加入50LBUFFER。70水浴锅加热十分钟，置于30保存。2SDSPAGE电泳1清洗玻璃板，配制浓缩胶与分离胶，配方为10分离胶（两块）5浓缩胶（两块）DDH2O4ML30聚丙烯酰胺33MLPH88TRISHCL25ML10SDS100LTEMED4LDDH2O34ML30聚丙烯酰胺083MLPH86TRISHCL063ML10SDS50LTEMED5ML2按上面的配方配10分离胶和5的浓缩胶，摇匀灌胶。3加异丙醇压平，待分离胶凝固倒去胶上层异丙醇并用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，插入梳子。4待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。5将一步收的蛋白样品上样检测，每孔10L，MARKER每孔加1L。90V至溴酚兰刚跑出，终止电泳，进行转膜。3转膜1依据胶的大小剪取膜和滤纸，放入转移缓冲液中平衡10MIN。PVDF膜用纯甲醇浸泡饱和35S。2装配转移三明治海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。胶放于负极面（黑色面）。3将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，300MA,90MIN。检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。4免疫反应1将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液（含5脱脂奶粉的TBST），室温40CIRCLE下摇床上摇动封闭1H。2用TBST在室温下摇床上洗三次，每次5MIN。3将一抗用抗体稀释液稀释至适当浓度；室温下孵育2H或者4孵育过夜，用TBST洗三次，每次5MIN。4同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1H后，用TBST在室温下摇床上洗两次，每次10MIN；再用TBS洗两次，每次10MIN。5化学发光法检测1根据膜的大小，按每10CM2膜混合1ML溶液A和1ML溶液B，混匀，配制成发光检测工作液。2膜的蛋白面朝上，置于洁净保鲜膜上。将配制的发光检测液转移到蛋白膜上，使其均匀覆盖，室温孵育12分钟。3暗室中曝光，根据其曝光强度，缩短或延长曝光时间，保存图片。246过表达质粒的构建PCR反应体系为50ULKODPLUSNEO10PCRBUFFERFORKODPLUSNEO5L2MMDNTPS5L25MMMGSO43LSENSEPRIMER10UM1LANTISENSEPRIMER10UM1LCDNA模板200NGKODPLUSNEOENZYME1LDDH2O补齐至50L反应条件为95,3MIN98,10S退火温度6130S35CYCLE68150S68,5MIN将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，后选择2KB条带进行胶回收，按说明书中操作步骤进行。后双酶切37过夜。双酶切体系（20L）XHOI2LBAMHI2LTANGOBUFFER2L质粒2L胶回收产物2LH2O补齐至20L将酶切过夜后的质粒和基因片段进行凝胶电泳，选择7KB和2KB的条带做胶回收。将胶回收产物进行连接反应。反应体系BUFFER2LLIGASE1L载体基因片段摩尔质量比14（质粒100NG）水补齐至20L在PCR仪上连接221H连接结束后，进行质粒转化取DH5一支，瞬离后，将连接产物全部加入，冰浴30MIN。后热激4290S，放冰上12MIN后，加入无抗性LB200L，3740MIN后，与无菌操作台中涂板，过夜。过夜后取出培养板（带有氨苄抗性），挑选单个菌落，加入4ML带有氨苄抗性的LB培养基，摇菌37过夜。按照小质量质粒提取试剂盒说明进行质粒提取，测浓度和纯度260NM/280NM比值。取1G质粒提取物双酶切2H，鉴定质粒，体系同上。将四管细菌送公司（INVITROGEN）测序，质粒于20保存。247酶联免疫吸附测定法操作步骤1加样分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品而SIRNA干扰PD1可以部分模拟缺氧对H1N1刺激的巨噬细胞分泌IFN1、TNF和IL6的促进效应。RAW2647细胞转染PD1SIRNA48小时后，给H1N1病毒刺激，在相应时间点收集细胞WESTERNBLOT检测蛋白相关蛋白水平图4C）。相比于干扰对照组，特异性干扰PD1组的巨噬细胞在H1N1病毒刺激下SHP2活化水平降低，并表达高水平的RIGI蛋白。巨噬细胞在H1N1病毒刺激表达低水平PSHP2和高水平的RIGI蛋白。图3缺氧对PD1表达的影响。左图为对照组，右图为受病毒感染的巨噬细胞PD1在缺氧和常氧条件下的表达。FIG3THEEFFECTOFHYPOXIAONMACROPHAGELEFTPICTUREISTHECONTROLGROUPRIGHTPICTUREISTHEEXPRESSIONOFPD1INMACROPHAGEINFECTEDBYVIRUSUNDERHYPOXICANDNORMOXICCONDITIONS图4缺氧通过PD1依赖的机制调控RIGI的表达图4APD1过表达时巨噬细胞表达IFN、TNF、IL6的水平。图4BPD1表达下调时巨噬细胞表达IFN、TNF、IL6的水平。图4C左图是干扰对照组，右图为转染PD1SIRNA巨噬细胞相关蛋白的表达水平。FIG4HYPOXIAREGULATESTHEEXPRESSIONOFRIGITHROUGHPD1DEPENDENTMECHANISMFIG4ATHEEXPRESSIONOFIFN、TNFANDIL6INMACROPHAGEWHENOVEREXPRESSPD1FIG4BTHEEXPRESSIONOFIFN、TNFANDIL6INMACROPHAGEWHENDOWNREGULATEPD1FIG4LEFTPICTUREISTHECONTROLGROUPOFINTERFERENCERIGHTPICTUREISTHEEXPRESSIONOFTHEPROTEINRELATEDINMACROPHAGETRANSFECTEDBYPD1SIRNA32讨论机体免疫系统的中心任务是区分自我和非我，识别和消除侵袭的病原微生物，我们通过实验发现缺氧显著促进巨噬细胞对H1N1流感病毒的免疫应答。RIG样受体作为模式识别受体可以识别病毒DSRNA，激活下游信号级联反应。诱导进而激活特定的细胞因子和趋化因子的表达，RIG属于解旋酶家族，其N段含有两个串联的级联激活和招募结构域CASPASEACTIVATIONANDRECRUITMENTDOMAINS,CARDS。这些结构域的相互作用促进了RIG结合到下游同样含有CARD结构域的重要的接头分子MAVS（MITOCHONDRIALANTIVIRALSIGNALINGPROTEIN）,引起MAVS的活化，进而将信号转导给下游的TRAF3（TUMORNECROSISFACTORTNFRASSOCIATEDFACTOR3）、TBK1激酶和IKK1复合体，进而磷酸化活化IRF3/729，活化的IRF3/7转移至细胞核内，并诱导型干扰素的产生，而活化的MAVS还可以通过TRAF2/6或者FADD（FASASSOCIATEDDEATHDOMAIN）、RIP1（RECEPTORINTERACTINGPROTEIN1）、TRADD（TANKBINDINGKINASE1）CASPASE8/10通路将信号转到给IKK复合物，最后导致NFB和IKB复合物的磷酸化，磷酸化的IKB从NFB上脱落并降解，活化的NFB入核促进促炎症因子和炎性趋化因子的产生30，从而抑制病毒的复制和传播，同样RIGI通路也可被泛素化负调控，E3泛素酶可以将K48泛素链结合到RIGI，促进其被蛋白酶体降解31，泛素化修饰可以作用于信号通路中的各种分子来抑制RLR信号通路的转导。PD1PDL1途径对外来抗原进行免疫应答表现为负性免疫调节功能32，PD1可募集酪氨酸磷酸酶和增加SHP2的磷酸化，SHP2的活化可以促进RIG蛋白的泛素化和降解，起到免疫负向调控作用。本实验通过腹腔注射H1N1流感病毒构建小鼠感染暴发模型，并给予氯化钴注射（诱导缺氧信号）和高压氧疗（纠正缺氧）处理，及相应对照组（H1N1氯化钴实验组、H1N1氧疗实验组，和H1N1PBS实验组、PBS氯化钴对照组、PBS氧疗对照组、PBSPBS对照组）。我们发现相比于H1N1PBS实验组，H1N1氯化钴实验组小鼠生存率显著降低，ELISA检测发现H1N1氯化钴实验组小鼠血清I型干扰素和炎症因子TNF和IL6水平明显高于H1N1PBS实验组；而H1N1氧疗实验组小鼠生存率显著高于H1N1PBS实验组，其血清IFN1、TNF和IL6水平也低于H1N1氯化钴实验组和H1N1PBS实验组。该结果提示组织缺氧和低血氧症可能是重症呼吸道病毒感染宿主体内细胞因子风暴产生的重要病理基础之一。鉴于巨噬细胞在抗病毒免疫应答中的重要作用，我们首先检测缺氧影响其抗病毒免疫应答反应能力。我们发现在低氧环境中，巨噬细胞对H1N1病毒刺激的应答显著增加，产生的IFN1、TNF和IL6水平显著高于常氧（21O2）培养H1N1刺激组。该结果与小鼠体内实验结果是一致的。为了进一步研究缺氧调控巨噬细胞分泌I型干扰素和炎症因子的机制，我们筛查了可能相关的免疫调节分子，发现H1N1流感病毒刺激显著上调巨噬细胞膜表面的免疫抑制性受体PD1的表达。但在低氧培养系统里，H1N1诱导的PD1表达显著被抑制；更重要的是，在巨噬细胞上过表达PD1部分中和了缺氧对巨噬细胞抗病毒应答反应的促进作用。而SIRNA干扰PD1显著增强巨噬细胞抗病毒反应强度。SHP2的活化可以促进RIGI蛋白的泛素化和降解，而PD1与配体结合后，胞内ITIM序列招募并活化SHP2，介导信号的下游传导，缺氧通过下调PD1的表达，抑制SHP2活化，进而上调RNA病毒受体RIGI的表达。而对低氧处理的巨噬细胞检测发现其SHP2磷酸化水平显著下调，而RIGI表达水平增加。33结论体内试验和体外实验表明，在缺氧条件下，H1N1流感病毒刺激，巨噬细胞对病毒的固有免疫应答会显著增强，产生的IFN1、TNF和IL6水平显著高于常氧培养的巨噬细胞，并且缺氧抑制病毒感染介导的PD1的上调，和SHP2的活化，从而阻断了对RIGI信号的负反馈机制，导致RIGI蛋白水平显著增加（HYPOXIAHIFSPD1SHP2RIGI轴），诱发过度的抗病毒免疫应答，造成干扰素和炎症因子的体内大量聚集，增加小鼠的死亡率。参考文献1NISHIYAMAM,YOSHIDAY,SATOM,NISHIOKAM,KATOT,KANAIT,ISHIWATAT,WAKAMATSUH,NAKAGAWAS,KAWANAA,NONOYAMASCHARACTERISTICSOFPAEDIATRICPATIENTSWITH2009PANDEMICINFLUENZAAH1N1ANDSEVERE,OXYGENREQUIRINGPNEUMONIAINTHETOKYOREGION,1SEPTEMBER31OCTOBER2009EUROSURVEILL2010,152MORINETF,CASETTIL,FRANCOISJH,CAPRONC,PILLETSOXYGENTENSIONLEVELANDHUMANVIRALINFECTIONSVIROLOGY2013,44431363CHENE,WANGF,LVH,ZHANGY,DINGH,LIUS,CAIJ,XIEL,XUX,CHAIC,ETALTHEFIRSTAVIANINFLUENZAAH7N9VIRALINFECTIONINHUMANSINZHEJIANGPROVINCE,CHINAADEATHREPORTFRONTMED2013,73333444CHENY,LIANGW,YANGS,WUN,GAOH,SHENGJ,YAOH,WOJ,FANGQ,CUID,ETALHUMANINFECTIONSWITHTHEEMERGINGAVIANINFLUENZAAH7N9VIRUSFROMWETMARKETPOULTRYCLINICALANALYSISANDCHARACTERISATIONOFVIRALGENOMELANCET2013,381191619255VINCENTRN,MOOREJ,BEEKMANRH,BENSONL,BERGERSENL,HOLZERR,JAYARAMN,JENKINSK,RINGELR,ROMEJ,MARTINGRPROCEDURALCHARACTERISTICSANDADVERSEEVENTSINDIAGNOSTICANDINTERVENTIONALCATHETERISATIONSINPAEDIATRICANDADULTCHDINITIALREPORTFROMTHEIMPACTREGISTRYCARDIOLYOUNG2015196WENH,LEIY,EUNSY,TINGJPPLEXINA4SEMAPHORIN3ASIGNALINGISREQUIREDFORTOLLLIKERECEPTORANDSEPSISINDUCEDCYTOKINESTORMJEXPMED2010,207294329577TEIJAROJR,WALSHKB,RICES,ROSENH,OLDSTONEMBMAPPINGTHEINNATESIGNALINGCASCADEESSENTIALFORCYTOKINESTORMDURINGINFLUENZAVIRUSINFECTIONPROCNATLACADSCIUSA2014,111379938048WALSHKB,TEIJAROJR,WILKERPR,JATZEKA,FREMGENDM,DASSC,WATANABET,HATTAM,SHINYAK,SURESHM,ETALSUPPRESSIONOFCYTOKINESTORMWITHASPHINGOSINEANALOGPROVIDESPROTECTIONAGAINSTPATHOGENICINFLUENZAVIRUSPROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCESOFTHEUNITEDSTATESOFAMERICA2011,10812018120239JANEWAYCA,JRAPPROACHINGTHEASYMPTOTEEVOLUTIONANDREVOLUTIONINIMMUNOLOGYCOLDSPRINGHARBSYMPQUANTBIOL1989,54PT111310LOOYM,GALEM,JRIMMUNESIGNALINGBYRIGILIKERECEPTORSIMMUNITY2011,3468069211OSORIOF,REISESOUSACMYELOIDCTYPELECTINRECEPTORSINPATHOGENRECOGNITIONANDHOSTDEFENSEIMMUNITY2011,3465166412ELINAVE,STROWIGT,HENAOMEJIAJ,FLAVELLRAREGULATIONOFTHEANTIMICROBIALRESPONSEBYNLRPROTEINSIMMUNITY2011,3466567913DALODM,SALAZARMATHERTP,MALMGAARDL,LEWISC,ASSELINPATURELC,BRIEREF,TRINCHIERIG,BIRONCAINTERFERONALPHA/BETAANDINTE