GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验

016食品安全国家标准食品微生物学检验 016 前 010食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验、01722010进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法、21542008进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法 兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术。010相比,主要变化如下:化钠肉汤。0161 食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验1 范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(检验方法。本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品中金黄色葡萄球菌的计数。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:温培养箱:361。箱:25。温水浴箱:3656。平:质器。荡器。菌吸管:110微量移液器及吸头。菌锥形瓶:容量10000菌培养皿:直径90布棒。 化钠肉汤:琼脂平板:心浸出液肉汤(血浆:释液:磷酸盐缓冲液:养琼脂小斜面:兰氏染色液:菌生理盐水:一法 金黄色葡萄球菌定性检验4 检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。0162 图1 金黄色葡萄球菌检验程序5 化钠肉汤的无菌均质杯内,8000r/0000r/化钠肉汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1样品为液态,化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀。菌将上述样品匀液于361培养18h24h。化钠肉汤中呈混浊生长。离将增菌后的培养物,分别划线接种到平板361培养18h24h。1培养24h48h。步鉴定金黄色葡萄球菌在面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(0163 色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,m。浆凝固酶试验:挑取于5个全选),分别接种到561培养18h24h。入小试管中,荡摇匀,置361温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到561培养18h48h,重复试验。萄球菌肠毒素的检验(选做)可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录 果判定:判定为金黄色葡萄球菌。果报告:在25g(品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。第二法 金黄色葡萄球菌平板计数法7 检验程序金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序见图2。图2 0164 8 体和半固体样品:称取25000r/0000r/置于盛有225拍击式均质器拍打1成110的样品匀液。体样品:以无菌吸管吸取25内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成110的样品匀液。10样品匀液1管壁缓慢注于盛有9意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1成1100的样品匀液。备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,后用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如放在2550的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。养在通常情况下,涂布后,将平板静置10样液不易吸收,可将平板放在培养箱361培养1h;等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于361培养24h48h。黄色葡萄球菌在面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在2000数典型菌落数。典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验。分别做染色镜检,血浆凝固酶试验(同时划线接种到血平板361培养18h24黄色葡萄球菌菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。9 只有一个稀释度平板的典型菌落数在20000165 落,按式(1)计算。最低稀释度平板的典型菌落数小于20数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。某一稀释度平板的典型菌落数大于200下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。某一稀释度平板的典型菌落数大于200下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在2000计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。2个连续稀释度的平板典型菌落数均在2000式(2)计算。算公式式(1):T=(1)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A某一稀释度典型菌落的总数;B某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;C某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;d稀释因子。式(2):T=1+(2)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;计算系数;d稀释因子(第一稀释度)。10 报告根据9中公式计算结果,报告每g(品中金黄色葡萄球菌数,以g(示;如以小于1乘以最低稀释倍数报告。第三法 金黄色葡萄球菌验程序金黄色葡萄球菌0166 图3 金黄色葡萄球菌据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,化钠肉汤管(如接种量超过1化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物361培养,18h24h。化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于1培养,24h48h。进行。13 结果与报告根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数,查附录C),报告每g(品中金黄色葡萄球菌的最可能数,以g(示。0167 附 录 分蛋白胨 75 法将上述成分加热溶解,装,每瓶22521高压灭菌15分豆粉琼脂(00兔血)5法加热溶化琼脂,冷却至50,以无菌操作加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板。分胰蛋白胨 菌剂的配法30%碲酸钾溶液10存于冰箱内。0168 法将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,装每瓶9521高压灭菌15用时加热溶化琼脂,冷至50,每95卵黄亚碲酸钾增菌剂5养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。心浸出液肉汤( 成分胰蛋白质胨 2 法加热溶解,装1660管515蒸馏水100解后过滤,装瓶,121高压灭菌15血浆制备:檬酸钠溶液一份,加兔全血4份,混好静置(或以3000r/使血液细胞下降,即可得血浆。分磷酸二氢钾( 法贮存液:大约175蒸馏水稀释至1000释液:蒸馏水稀释至1000装于适宜容器中,121高压灭菌15分蛋白胨 0169 牛肉膏 法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化,分装133021高压灭菌15分结晶紫 醇 酸铵水溶液 法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。分碘 法将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300 分沙黄 醇 法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。色法a) 涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1洗。01610 b) 滴加革兰氏碘液,作用1洗。c) 滴加95%乙醇脱色约15s30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。d) 滴加复染液,复染1洗、待干、镜检。分氯化钠 21高压灭菌1501611 附 录 剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯,试验用水应符合6682对一级水的规定。、B、C、D、 、温度冷至室温后,加42 取分混匀即可。烷。0%次氯酸钠溶液。分蛋白胨 200基酸)氯化钠 制法将所有成分混于水中,溶解后调节21高压灭菌30 分蛋白胨 法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%01612 加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化。分装烧瓶,121高压灭菌15子天平: 均质器。心机:转速3000g5000g。心管:50 滤器: 微量加样器:20L200L、200L1000L。量多通道加样器:50L300L。动洗板机(可选择使用)。标仪:波长450理本方法可用A、B、C、D、方法测定的基础是酶联免疫吸附反应(96孔酶标板的每一个微孔条的A、C、D、孔为阳性质控,已包被混合型葡萄球菌肠毒素抗体,被了非免疫动物的抗体。样品中如果有葡萄球菌肠毒素,游离的葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的特定抗体结合,形成抗原抗体复合物,其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉;抗原抗体复合物再与过氧化物酶标记物(二抗)结合,未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉;加入酶底物和显色剂并孵育,酶标记物上的酶催化底物分解,使无色的显色剂变为蓝色;加入反应终止液可使颜色由蓝变黄,并终止了酶反应;以450品中的葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比。分离菌株培养物中检测葡萄球菌肠毒素方法待测菌株接种营养琼脂斜面(试管18806培养24h,用5入606振荡培养48h,振速为100次/出菌液离心,8000r/热100,10上清液,取100 奶和奶粉将25匀后同液体牛奶一样按以下步骤制备。将牛奶于15,3500表面形成的一层脂肪层移走,变成脱脂牛奶。用蒸馏水对其进行稀释(120)。取100肪含量不超过40%的食品称取10摇1515,01613 10要时,移去上面脂肪层。取上清液进行过滤除菌。取100肪含量超过40%的食品称取10摇1515,3500取5移到另外一个离心管中,再加入5分混匀515,3500上部有机相(庚烷层)全部弃去,注意该过程中不要残留庚烷。将下部水相层进行过滤除菌。取100他食品可酌情参考上述食品处理方法。有操作均应在室温(2025)下进行,A、B、C、D、定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头,用过的吸头以及废液处理前要浸泡到10%次氯酸钠溶液中过夜。所需数量的微孔条插入框架中(一个样品需要一个微孔条)。将样品液加入微孔条的A孔100L。手轻拍微孔板充分混匀,用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发,置室温下孵育1h。孔中液体倾倒至含10%次氯酸钠溶液的容器中,并在吸水纸上拍打几次以确保孔内不残留液体。每孔用多通道加样器注入250倾倒掉并在吸水纸上拍干。重复以上洗板操作4次。本步骤也可由自动洗板机完成。孔加入100手轻拍微孔板充分混匀,置室温下孵育1h。50拍混匀,室温黑暗避光处孵育30入100硫酸终止液,轻拍混匀,30 果不能同时满足以上要求,测试的结果不被认可。对阳性结果要排除内源性过氧化物酶的干扰。界值的计算每