正交设计优化黄瓜issr体系

正交设计优化黄瓜ISSR体系分子植物育种,2006年,第4卷,第3期,第439442页MOLECULARPLANTBREEDING,2006,VO14,NO3,439442新思路,新技术,新方法NOVELTHINKINGTECHNOLOGY正交设计优化黄瓜ISSR体系王佳梁国华缪曼珉陈学好扬州大学植物功能基因组学教育部重点建设实验室,扬州,225009通讯作者,CHENXHLIUYAHOOTOMCA摘要黄瓜是一种重要的蔬菜作物,品种资源较为丰富,利用分子标记进行黄瓜资源鉴定和分类,构建分子遗传图谱和基因定位方面已取得一定进展,目前应用的分子标记主要包括RAPD,AFLP和SSR,尚未见有关于ISSR标记在黄瓜上的研究报道ISSR主要是由单一引物且以重复序列为主要引物序列的PCR标记,其反应条件受模板DNA,TAQDNA聚合酶,M,DNTPS和引物等因素的影响正交试验设计能明确各因素问的互作效应,建立最优化的反应体系本研究利用这一方法,从TO酶,DNTPS,引物,M4种因素各3个水平来优化黄瓜ISSR反应体系通过实验,在251XL反应体系中初步确定各反应成分为LXPCRBUFFER,15MMOL/LM,25NG黄瓜模板DNA,DDH2O,1UTAQ酶,2001XMOL/LDNTPS,075PANOL/L引物这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行黄瓜种质资源分类,遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础关键词黄瓜,ISSR,正交OPTIMIZATIONFORISSRREACTIONSYSTEMINCLL,CUMISATIVUSLUSINGORTHOGONALDESIGNWANGJIALIANGGUOHUAMIAOMINMINCHENXUEHAOKEYLABORATORYOFEDUCATIONMINISTRYFORPLANTFUNCTIONGENOMICS,YANGZHOUUNIVERSITY,YANGZHOU,225009CORRESPONDINGAUTHOR,CHENXHLIUYAHOOCOMCAABSTRACTCUCUMBERCUCUMISSATIVUSLISAVERYIMPORTANTVEGETABLECROPWITHALLABUNDANTGERMPLASMSMUCHPROGRESSHASBEENMADEONEVALUATIONANDCLASSIFICATIONOFGERMPLASMS,ANDMAPPINGANDGENELOCALIZATIONOFCUCUMBERWITHMOLECULARMARKERSSUCHASRAPD,AFLPANDSSR,ISSRISAMOLECULARMARKERTAKINGREPEATSEQUENCESASMAJORPRIMERSEQUENCEBASEDONPCRORTHOGONALDESIGNCANDETERMINATEINTERACTIONSOFEACHFACTOR,THEREFOREBESTREACTIONSYSTEMSCANBEESTABLISHEDINTHISSTUDYORTHOGONALDESIGN,ITLLTHREELEVELSOFFOURFACTORSROQDNAPOLYMERASE,DNTPS,PRIMERANDMWASUSEDTOOPTIMIZETHECUCUMBERISSRREACTIONSYSTEMTHERESULTSSHOWEDTHATABETTERAMPLIFICATIONOFISSRWASOBTAINED,ITHTHEREACTIONSYSTEMCONTAININGIXPCRBUFFER15MMOL/LMR,25NGTEMPLEDNAOFCUCUMBER,1UDNAPOLYMERASE,200PANOL/LANTES,075PANOL/LPRIMERINTHETOTALVOLUMEOF251X1ITPROVIDEDTHEBASISFORTHEANALYSISOFDIVERSITY,MAPCONSTRUCTIONANDGENELOCALIZATIONOFIMPORTANTTRAITSINCUCUMBER,ITLLISSRMARKERS,KEYWORDSCUCUMISSATIVUSL,ISSR,ORTHOGONALDESIGNISSRINTERSIMPLESEQUENCEREPEAT是由ZIETLDEWICZ等在L994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记其原理是根据真核生物基因组中广泛存在的简单重复序列,设计出各种能与SSR序列结合的PCR单一引物,对两个相距较近,方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增,能比RFLP和RAPD提供更多的遗传信息ISSR标记通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,具有很好的稳定性和多态性TSUANURAETA1,1996,DNA用量少,技术要求不高与RAPD相比,ISSR更可靠,重复性更高,每个引物能产生更高的多态性,同时具备RAPD的简便及易操作性与RFLP,AFLP相比,ISSR更快捷,稳定,安全性更高与SSR相比,ISSR不需要预先获知序列信息,程序简化因而成本更低这分子植物育种MOLECULARPLANTBREEDING种技术现已广泛用于品种鉴定CULLEYANDWOLFE,20011,遗传作图WOLFEETA1,1998,基因定位,遗传多样性分析李海生,2004,生物学通报,3921921等方面在水稻,油菜和大豆等作物上已广泛应用何予卿等,2001马朝芝等,2003汪岚等,2004黄瓜是一种重要的蔬菜作物,品种资源较为丰富,中国黄瓜育种工作自上世纪60年代以来取得了很大成绩,育出了以津研系列为代表的一大批优良黄瓜品种近年来,黄瓜分子育种已开始起步,利用分子标记进行黄瓜资源鉴定和分类,构建分子遗传图谱和基因定位方面已取得一定进展,目前应用的分子标记主要包括AFLP李锡香等,2004A和RAPD李锡香等,2004B,尚未见有关于ISSR标记在黄瓜上的研究报道由于ISSR主要是由单一引物且以重复序列为主要引物序列的PCR标记,所以其反应条件易受许多因素的干扰,如模板DNA,TAQDNA聚合酶,MG2,DNTPS,引物等浓度都能影响ISSRPCR扩增的结果各因素间互相影响,必须搞清各因素间的互作效应,才能建立最优化的反应体系而正交试验设计具有均衡分散,综合可比及可伸可缩,效应明确的特性,了解各因素之间的内在规律,较快地找到最优水平的组合盖钧镒,2000王彦华等2004和谢运海等2005分别在不结球白菜和水曲柳上运用正交实验设计的方法优化了ISSR反应体系本实验从TAQ酶,DNTPS,引物,MG24种因素3个水平,对黄瓜ISSR反应体系进行优化分析,皆在为今后利用ISSR技术分析黄瓜的种质资源,遗传图谱构建和基因定位奠定基础1材料与方法表1PCR正交设计表TABLE1ORTHOGONALDESIGNOFPCRREACTION11材料黄瓜品种为SUMTER,2005年3月15日在扬州大学农学院园艺系试验大棚内采用穴盘育苗的方法培育幼苗,待幼苗长至2片真叶时取嫩叶于液氮中冰冻后在40冰柜中保存提取的DNA作为ISSRPCR反应体系的模板实验用ISSRPCR反应的TAQ酶购自TAKARA公司经初步筛选的引物为A34,A34引物序列为GSGGT,M,DNTPS购自上海生物工程公司12DNA的提取采用改良过的CTAB法提取DNA用08的琼脂糖电泳检测DNA质量13正交设计PCR体系采用K正交表设计,由TAQ酶,DNTPS,引物和M4种因素各3个水平组成表1反应体系中总体积为251ZL,包括1XPCRBUFFER,模板DNA25NG,其它各成分按照表1加样,最后用DDH20补足每个处理做3次重复反应程序为94预变性5RAIN94C变性30S,52退火30S,72延伸75S,循环42次72延伸10MIRA4保存反应结束后,PCR产物在含有05G/MLEB的30琼脂糖凝胶中电泳LH,UVP凝胶成像系统进行拍照分析2结果与分析依据琼脂糖电泳条带的强弱和杂带的多少做直观分析从图1中可以看到,13号处理中,条带很弱,ROQ酶用量为05U,但随着其它成分的增多,条交改优化黄瓜ISSR体系1PCR产物L皂泳缩L9号址摊号参丧1FIGUREIEECTROPHORESISRESULT0ILPCRPRODUCTSNORE【9TREATMENTNUMBERSHOWEDII_TABLE带对增强46号处媸中,随为TU,条带鞍为清晰且亮度较大特别是5号请晰皮和亮度最好79处理C锄酶为15U能扩埔山条带,经济的角度来看TUT酶FJ用量为L较为合适,此I_J知TUT酶为反应的上要影响素4号和7号址理【J,DNTPS浓度均为150XMOT,L,物车I对较少,丰带和副带不IJ腽6号处理1杂带较多,卫带少9号处理扣扩增的条带多世不清晰综合各素弩啦,5号处理,生带副带情晰亮度高为垃佳组台H此得山黄瓜ISSRPCR反应T总体秘为25TTL的最佳反应体系为静LU,DNTPS2001XMOL/L,引物075PMOL/L,M15MMOL/L3讨论本文利用正交试验设计方法锕步建立并优化了黄瓜ISSR标记的PCR反虚体系这反应体系受诸多J剖素的影响包扦黄瓜酶,M浓瞍,DNTPS,引物和DNA模扳等备反应成分都会影响PCRR物的生成和质量7曲DNA聚合鹣是PCR反应中不町缺少的浓度过高可引起非特异扩增,浓度过低则台成产物量减少一般用量为0525U卉本体系中以LU为合理用量M浓度对PCR扩增的特异性和产量有硅着的影响,M浓度过高,反应特异性降低,出现非特异性扩增,浓度过低则会降低_啪DNA聚合酶的活性,使反应产物减少本实骑设计15MMOFL,20MMOI,L,25MMOL/L这3个水平最适浓度为I5MMOL/LDNTPS是PCR反应的原料浓度过低会降低PCR物的产量,同时,DNTP能与M结合浓度过高将使游离的M浓度降低本体系的适宜DNTPS浓度为200BTSNOL,RL引物是获得PCR特异性反应的关键,每引物为01101XMOUL的浓度以最低引物量产生所需的结果为,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,LL会增加引物之问形成二聚体的机会本实验采用的3个引物浓度梯度为025MOL/L,050TTMOL/K,0750MOL/L,综合比较认为075MOL/L比较适合奉反J娅体系模板DNA的量与纯化枉度足PCR成败与否的天键王F,之,本实验虽然未对摸板DNA的浓度进行试验,根据同为葫芦科怍物西瓜E的研究成果L11】选择樘板DNA的量为25NG,取得了较为理想的结果就反应穿而言,变性,退火祁延伸的时间温度对反应结粜有定的影响,特刖是退火温度埘其影响更_人不FLI_F的引物有其特异的退火温度本体系中引物退火温度根据经骀确定若选用1同的引物还需通过实验优化在反应体系中加入甘油可以稳定7DNA聚合酶,提高反府的特异性,有时在反应体系中加入白明皎,BSA或TRITONXL00NAGAOKAANDOGIHATA,L997等物质也可达到此效果另外,在ISSR反应体系中加入24DMSOJOSHIETA12000或2甲酰胺QIUETA1,2002,亦可以提高反应的特异性在以后的实骗中可根据实验的需要选用致谢本百卅究由江苏省农高技术项目BG2004313资助参考文献CULLEYTMANDWOLFEAD2001POPULATIONGENETICGCMREOFTHECLEISTOGAMOUSPTANTSPECIESVIOLAPUBESCEALTONFVIOLACEAEASINDICATEDBYALLOZYMEANDISSRMOLECULARMARKERS,HEREDITY86PT5545556GAIJYED2000,METHODSOFEXPERIMENTATIONANDSTATISTICS,CHINAAGNCULTURALPRESS,BEIJING,CHINA,PP286297盖钧2B镒,编着,2000,试验统计方法,中国农业出版社,北京,PP286287HEYQ,ZHANGY,SUNM,HEGC,WANGSW,ANDZHUYG,200ISTUDIESONTHERELATIONSHIPBETWEENCULTIVATEDANDWILDRICEUSINGISSRMARKERS,NONGYESHENGWUJISHUXUEBAOJOURNALOFAGRICULTURALBIOTECHNOLOGY,92123L27何予卿,张宇,孙梅,何光存,王松文,朱英国,2001,利用ISSR分子标记研究栽培稻和野生稻亲缘关系,农业生物技术,92123127JOSHISPGUPTAVS,AGGARWALR_K_,RANJEKARPK,ANDBRARDS,2000,GENETICDIVERSITYANDPHYLOGENETICRELATIONSHIPASREVEALEDBYINTERSIMPLESEQUENCEREPEATISSRPOLYMORPHISMINTHEGENUSORYZA,THEORAPP1GENEL10013LLL320LIXX,ZHUDW,DUYC,SHEND,KONGQSANDSONGJP,2004A,STUDIESONGENETICDIVERSITYANDPHYLOGENETICRELATIONSHIPOFCUCUMBERCUCUMISSATIVUSLGERMPLASMBYAFLPTECHNIQUE,YUANYIXUEBAOACTAHORTICULTURAESINICA,3L3309314李锡香,朱德蔚,杜永臣,沈镝,孔秋生,宋江萍,2004黄瓜种质资源遗传多样性及其亲缘关系的AFLP分析,园艺,3L3309314LIXX,ZHUDW,DUYC,ZHANGGPANDSHEND,2004B,GENETICDIVERSITYANDPHYLOGENETICRELATIONSHIPOFCUCUMBERCUCUMISSATIVUSLGERRNPLASMBASEDONRAPDANALYSIS,ZHIWUYICHUANZIYUANXUEBAOJOUMALOFPLANTGENETICRESOURCES,52147152李锡香,朱德蔚,杜永臣,张广平,沈镝,2004B,黄瓜种质资源遗传多样性的RAPD鉴定与分类研究,植物遗传资源,52147152MACZ,FUTD,TUEVESSONS,ANDGEITSSONB,2003,GENETICDIVERSITYOFCHINESEANDSWEDISHRAPESEEDBRASSICARTAPTLLANALYSEDBYINTERSIMPLESEQUENCEREPEATSISSRS,ZHONGGUONONGYEKEXUESCIENTIAAGRICULTURASINICA,361114031408马朝芝,傅廷栋,STINETUEVESSON,BOGEITSSON,2003,用ISSR标记技术分析中国和瑞典甘蓝型油菜的遗传多样性,中国农业科学,361114031408NAGAOKAT,ANDOGIHARAY,1997,APPLICABILITYOFINTERSIMPLESEQUENCEREPEATPOLYMORPHISMSINWHEATFORUSEASDNAMARKERSINCOMPARISONTORFLPANDRAPDMARKERS,THEORAPP1GENET,94597602QYX,FUCX,ANDKONGHH,2002,INTERSIMPLESEQUENCEREPEATOSSRANALYSISOFDIFFERENTCULTIVARSINMYR/O,NONGYESHENGWUJISHUXUEBAOJOURNALOFAGRICULTURALBIOTECHNOLOGY,L04343346TSUANURAY,OHBAK,ANDSTRAUSSSH,1996,DIVERSITYANDINHERITANCEOFINTERSIMPLESEQUENCEPOLYMORPHISMSINDOUGLASFIRPSENDOTAUGAMENZIESIIANDSUCRYPTOMERIAJAPONIC,THEORAPP1GENET,924045WANGL,HANYC,PENGYSTENGCZ,ZHOUMQ,HUZL,ANDSONGYC,2004,APPLICATIONOFISSRTECHNIQUETOGENETICRESEARCHOFLOTUSROOT,ANJISUANHESHENGWUZIYUANAMINOASCIDSBIOTICRESOURCE,2632022汪岚,韩延闯,彭欲率,滕彩珠,周明全,胡中立,宋运淳,2004,ISSR标记技术在莲藕遗传研究中的运用,氨基酸和生物资源,2632022WANGYH,HOUXLANDXUMY,2004,STUDYONOPTIMIZATIONFORISSRREACTIONSYSTEMOFBRASSICACAMPESTRISSSPCHINENSISUSINGORTHOGONALDESIGN,XIBEIZHIWUXUEBAOACTABOTANICABOREALIOCCIDENTALIASINICA,245899902王彦华,侯喜林,徐明宇,2004,正交设计优化不结球白菜ISSR反应体系研究,西北植物,245899902WOLFEAD,XIANG