[生物医药论文精品]胸腺五肽酶降解机制的研究

1胸腺五肽酶降解机制的研究摘要目的研究TP5在胃肠道中的酶降解机制。方法考察TP5在人工胃液、人工肠液、纯酶（氨肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶）以及离体肠环中的降解，并探讨TP5浓度、酶抑制剂及PH值对降解的影响。结果TP5在人工胃液中稳定，在人工肠液中迅速降解，具有浓度依赖性及PH依赖性，即浓度越高，PH值越低，则降解速率越低。同时酶抑制剂（EDTA、1,10菲啰啉）可显著地抑制其降解，但杆菌肽的抑制作用不显著。TP5在羧肽酶、氨肽酶及胰蛋白酶中的降解速率分别为1343,1282,511ML/MIN，但在糜蛋白酶中几乎不降解。此外，TP5的降解具有显著的部位特异性，在结肠部位的降解速率最低。结论TP5易被胃肠道中的酶降解破坏，口服无效。为了开发口服给药系统必须将TP5包载于适宜的载体之中。关键词胸腺五肽胃肠道酶降解A1A0A2A3A4A2A3R943A6A5A7A8A9A5A7A8A9AA6A10A11A4STUDYONTHEMECHANISMOFENZYMATICDEGRADATIONOFTHYMOPENTINABSTRACTOBJECTIVETOEVALUATETHEENZYMEDEGRADINGMECHANISMOFTP5INGITRACTMETHODSASYSTEMICRESEARCHONTP5DEGRADATIONWERECARRIEDOUTINARTIFICIALGASTRICJUICE,ARTIFICIALINTESTINALJUICE,PUREENZYMECARBOXYPEPTIDASEA,AMINOPEPTIDASEN,TRYPSIN,CHYMOTRYPSINANDEVERTEDINTESTINALRINGSRESULTSTP5WASSTABLEINARTIFICIALGASTRICJUICE,BUTRAPIDLYDEGRADEDINARTIFICIALINTESTINALJUICE,WHICHDEPENDENTONTP5CONCENTRATIONANDPHVALUE，THATISTHEHIGHERCONCENTRATIONANDLOWERPHVALUE,THELOWERDEGRADATIONCLEARANCEFURTHERMORE,ENZYMEINHIBITORSSUCHASEDTAAND1,10PHENANTHROLINECOULDSIGNIFICANTINHIBITTHEDEGRADATIONOFTP5,BUTBACITRACINHADNOTSIGNIFICANTLYDIFFERENTEFFECTINTHEPRESENCEOFPUREENZYME,THEDEGRADATIONCLEARANCESWERE1343,1282AND511ML/MINFORCARBOXYPEPTIDASEA,AMINOPEPTIDASENANDTRYPSIN,RESPECTIVELYHOWEVER,TP5COULDNOTBEDEGRADEDBYCHYMOTRYPSINFURTHERMORE,THEDEGRADATIONWASHIGHLYDEPENDENTONTHEINTESTINALSEGMENT,WITHTHELOWESTDEGRADATIONCLEARANCEOBSERVEDINTHECOLONCONCLUSIONSTP5WASAPTTODEGRADATIONINGASTROINTESTINETRACTFORORALADMINISTRATIONITMUSTBEENTRAPPEDWITHA12A13A14A15A16A17A18A19A20A21A22A23A13NO30430760A24A25A26A27A16A28A29A30A31A32A33A34A35A36A24A25A16A37A38A39A40A41A32A33A42A43EMAILA16ZQDODOBJMUDEUCN2SUITABLEDRUGDELIVERYSYSTEMSKEYWORDSTHYMOPENTINGASTROINTESTINEENZYMEDEGRADATION随着基因工程药物及生G2641G12197G4410研究的G17839G4649，蛋白G17148和G3822肽G12879药物G5062G6116为生物G6228G7427G7044药的G1039G16213G2709G12193，同G1268统的G2282G4410G2524G6116药物G11468G8616，G16825G12879药物G994体G1881G8503G5132生G10714物G17148G2325分G6521G17829，药G10714G8975性高，但G7171其体G1881、体外稳定性G5058，生物G2334G15940G7411G11713，G19668G16213G20069G13333用药，给G11161人G5114G7481G11183G14522和不G1427，因此G16780G3822研究G13785G14280G2159于G19762G8892G4568给药G17896G5464的研究，包G6336G21775G14120、口G14120、G11464肠、G13966部给药G12573，其中口服给药G7171G5751G13785最易G6521G2475的给药G17896G5464，G20046G5224性G3921，G7053G1427、G5567G6475，因此蛋白G17148、G3822肽G12879药物口服给药系统G5483G2052了G5203G8879的研究14。蛋白G3822肽G12879药物口服G2572G6922的G1039G16213G19568G11873G7171药物的G8712G9354性G4560G14280的不易G17340G14038G17148G14192G2572G6922以及药物易被G9052G2282道中的酶降解G3845G8975，G4600其对于G4579分G4388的肽G12879，在胃肠道中G7368G4493易被降解，G6164以酶降解机制的研究对于G19428G7138蛋白G3822肽G12879药物口服G2572G6922机G10714G19762G5132G18337G16213。G7424研究G17885用胸腺五肽（THYMOPENTIN,TP5）为G8181G3423药物，考察了人工胃液、人工肠液、纯酶（氨肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶）和不同部位的离体肠环对TP5的降解机制及酶抑制剂EDTA、1,10菲啰啉、杆菌肽对胃肠中酶降解G8975性的抑制作用，为TP5口服给药系统的研究G3892定基G11796。1材料与仪器试剂和药品G3783G13870G12970（G4677G1008G19750G4719G5617特有G19492G1856G2508，G14085G1069G18244度为90G705）G727G989G13870G11979G18252G19060（PENTASODIUMTRIPOLYPHOSPHATE，TPP，G3837G8953G5078G3837G8839G2282G4410G16809剂G2390）G727胸腺五肽（杭州中肽生G2282有G19492G1856G2508）G727EUDRAGITS100DARMSTADT，GERMANYG727G1069腈（色谱纯，FISHERCHEMICALS,USA）G727G989氟醋G18252（分析纯，北京兴G8953G2282工G2390）G727氨肽酶N（019U/ML，EC34112，MICROSOMALLEUCINEAMINOPEPTIDASE,SIGMA）G727羧肽酶A（01U/ML，EC34171，FLUKA）G727糜蛋白酶（45U/ML，EC34211，SIGMA）G727胰酶（胰蛋白酶不少于600UNITS/GPROTEIN，胰淀粉酶不少于7000UNITS/GPROTEIN胰G14038肪酶不少于4000UNITS/GPROTEIN,国药集团G2282G4410G16809剂有G19492G1856G2508）G727EDTA（分析纯）G727菲啰啉（1,10PHENANTHROLINE,PHT,国药集团G2282G4410G16809剂有G19492G1856G2508）G727杆菌肽（50,000UNITS/G,ALDRICHCHEMICALCOMPANY）G727其它G16809剂均为分析纯。仪器BP211D电G4388G3837平SARTORIUSG727HP1100高效液G11468色谱仪AGILENTTECHNOLOGIESUSAG727TL9000色谱工作站北京泰立G2282电G4388G6228G7427有G19492G1856G2508G727HYPERSIL3ODSC18色谱柱大连依利特分析仪器有G19492G1856G2508G727L870MG3423超速离心机BECKMANCORPORATION，USAG727粒度及表面电位分析仪（ZETASIZER3000HS,MALVEM,UK）G727傅立叶红外分光光度计（AVATAR360FTIR,AMERICA）G727磁G2159恒温搅拌器（上海曹行无线电元件G2390）实验动物SD大鼠（，200300G），北京大G4410医G4410部实验动物中心。2实验方法21人工胃液对TP5的降解211人工胃液的配制取稀盐G18252164ML，加G8712约800ML及胃蛋白酶10G，搅匀后加G8712定G4493至1000ML，即可。212人工胃液对TP5的降解实验采用外标一点法定量。精密称取TP5约10MG加入人工胃液8ML，37G8712浴，于不同时间点取样200L，以01M氢氧G2282G19060G9354液200L中止酶反G5224，以0MIN峰面积为100G705，计算各时间点的TP5剩余量。22人工肠液对TP5的降解221人工肠液的配制取G11979G18252二氢钾68G加G8712500ML，用01N氢氧G2282G19060G9354液调节PH至70G727另取胰酶10G加G8712适量使G9354解，将两液混G2524后，加G8712定G4493至1000ML，即可。222人工肠液对TP5的降解实验2221TP5浓度的影响人工肠液37G8975G228230MIN，取10ML分别加入TP5原药适量（TP5浓度分别为02、10、50MMOLL1），磁G2159搅拌混匀，于不同时间点取样200L，加入01MOLL1冰冷的高氯G18252200L终止反G5224，涡旋混G25241MIN，然后4000RPM离心10MIN，精密量取上清液20LG8892入液G11468色谱仪，记录色谱图，按标准曲线C82773105A00464（025GML1250GML1，09999）计算样G2709中的TP5含量。人工肠液通过煮沸G3845G8975作为阴性对照组。2222酶抑制剂的作用人工肠液中加入不同的酶抑制剂EDTA10MM、菲啰啉PHT,10MM和杆菌肽BACITRACIN,250U/ML，37G8975G228230MIN，各取10ML分别加入TP5原药适量（浓4度10MMOLL1），磁G2159搅拌混匀，以下操作同221。2223PH值的影响将人工肠液PH值调节至60，以下操作同221。23纯酶对TP5的降解5用KREBS缓冲液配制氨肽酶N（019U/ML），羧肽酶A（01U/ML），糜蛋白酶（45U/ML），胰蛋白酶（800U/ML）G9354液，37G8975G228230MIN，取各G9354液10ML分别加入TP5原药（浓度为10MMOLL1），磁G2159搅拌混匀，于不同时间点取样200L，加入01MOLL1冰冷的高氯G18252200L终止反G5224，涡旋混G25241MIN，然后4000RPM离心10MIN，精密量取上清液20LG8892入液G11468色谱仪，记录色谱图，按标准曲线C79655105A00723（021GML12120GML1，09998）计算样G2709中的TP5含量。同时以氨肽酶N、羧肽酶A、糜蛋白酶、胰蛋白酶通过煮沸G3845G8975的G7053法制备样G2709作为阴性对照组。24离体肠环对TP5的降解5G17885取25020G的G19608性SD大鼠，G16809验G2081G12117G2014724G4579时，G14270G11013G20290G8712G727G14157G14120G8892G456820G1056G6301G3386G9354液G21647G18269后，G8851G14157中线G6183开G14157G14120约15CM，G2110取G2325二G6363肠、G12366肠、G3250肠和结肠，用生G10714盐G8712冲G8939，外G13775并G2110取各肠G8585约05CM，即可G6930入10MLKREBSG9354液中，37温G1395820MIN，然后加入TP5原药（浓度为10MMOLL1和50MMOLL1），于不同时间点取样200L，加入01MOLL1冰冷的高氯G18252200L终止反G5224，涡旋混G25241MIN，然后4000RPM离心10MIN，精密量取上清液20LG8892入液G11468色谱仪，记录色谱图，按22G20045下的标准曲线计算样G2709中的TP5含量。25降解速率的计算方法通过降解清G19512率G7481定量表G17810TP5的酶降解速率，降解清G19512率的计算G1856G5347G3926下G726其中AUC为药物浓度时间曲线下面积，E为TP5G1207G16886的药物量，将不同时间点的AUCG994G13059积G1207G16886药物量EG13484制曲线，并将G16825曲线G17839行线性G3250G5414，其G7024率即为降解清G19512率CLDEG。26数据统计5采用MICROSOFTEXCEL2000G17731件对TP5在人工肠液、纯酶及离体肠环降解实验的G6980G6466G17839行G6116对G2464样G7424TG7828验。3结果31人工胃液对TP5的降解作用TP5在人工胃液中稳定，4H后TP5的药物浓度为G2033G3999浓度的9313G705，G1177降解687G705，G16277图1。012349092949698100TP5REMAINED/TIME/HFIG1TP5DEGRADEDINARTIFICIALGASTRICJUICE32人工肠液对TP5的降解作用人工肠液对TP5降解作用的结G7536G16277表1。通过G9921G9793G8975的人工肠液（阴性对照组）对TP5无降解作用（结G7536G7422显G12046）。TAB1DEGRADATIONCLEARANCESFORTP5INTHETHEPRESENCEOFARTIFICIALINTESTINALJUICEN3CONCENTRATIONINHIBITIONCONDITIONSDEGRADATIONCLEARANCEML/MIN02MM18630641MM15260775MM6090351MMEDTA0210031MMPHT01MMBACITRACIN13471381MMPH6821106P羧肽酶氨肽酶胃蛋白酶G301糜蛋白酶。34离体肠环对TP5的降解作用研究TP5的酶降解作用具有显著地部位特异性，外G13775肠环（G2325二G6363肠、G12366肠、G3250肠和结肠）的实验结G7536G3926图3G6164G12046。7DUODENUMJEJUNUMILEUMCOLON00010203040506DEGRADATIONCLEARANCEML/MININTESTINALSEGMENT1MMCONCENTRATION5MMCONCENTRATIONFIG3DEGRADATIONCLEARANCESOFTP5INTHEPRESENCESOFEVERTEDINTESTINALRINGSN3TP5在大肠部位（结肠）的清G19512率显著地低于G4579肠（G2325二G6363肠、G12366肠、G3250肠），并G1000G4579肠各部位的速率G1146有G5058别，TP5在G2325二G6363肠的降解速率低于G12366肠和G3250肠，并G1000TP5的降解具有浓度依赖性，G994表1结G7536G11468同，在G17751高浓度时降解速率G17751低。4讨论胸腺生G6116G13044（THYMOPOITENT,TP）G7171G1186人胸腺组G13467中分离G1998的一G1219349G1022氨基G18252的G3822肽，具有G1431G17839胸腺G13466G14002和外G2620TG13466G14002及BG13466G14002分G2282发G13958，调节机体G1825G11135G2163G14033G12573生物G8975性。人工G2524G6116的胸腺五肽（THYMOPENTIN,TP5）、胸腺G3247肽（THYMOCARTIN,TP4）和胸腺G989肽（THYMOTRINAN,TP3），分别G994TP的3236、3235和3234位氨基G18252G8543基G20046G5219G11468同，即ARGLYSASPVALTYR、ARGLYSASPVAL和ARGLYSASP。G17837G989G12193G4533肽G994TP具有G11468G1296的生物G4410G8975性，特别G7171TP5具有G2464G11468调节G1825G11135系统的G2163G14033，使过G5390G6122G2475G2052抑制的G1825G11135反G5224G17247G2533G8503G5132，其G10432特的生物G4410作用，使其G6116为一G12193G18337G16213的G1825G11135调节剂。TP5可G16837G4560TG13466G14002的分G2282、G3698G8554和G6116G10099，G3698加TG13466G14002的G2081体G52236。TP5在制剂的体外制备过程中稳定，但其G17839入体G1881后迅速被G15892G8986中的氨肽酶降解，T1/2约30G12198，降解G1147物为无G8975性的G3247肽（LYSASPVALTYL）和G989肽（LYSASPVAL）。肠道胰酶中的羧肽酶G7171G1820G1186羧G12483的G18238氨G18252（TYR）G8712解TP5，因此可G5483G2052G8975性G1147物TP4（ARGLYSASPVAL）和TP3（ARGLYSASP），G19512此之外G7422G16277有体G1881其G1194酶G1186羧G12483降解TP5的G7003G10498G6265道。G11013表2可G11705，羧肽酶G7171G5353G17227TP5肠道降8解的G1039G16213因G13044之一，因此TP5可在肠道中降解为有G8975性的G1207G16886物。G17839一G8505地，图3G6564G12046TP5的降解具有部位依赖性，在结肠G8585的降解速率最低，因此结肠G19786G2533制剂将有利于G6564高TP5的口服生物利用度。胸腺生G6116G13044口服有效，但TP5口服无效，被肠道G9052G2282酶迅速G1207G16886G13792G3845G8975。G17837可G14033G7171G11013于胸腺生G6116G13044G1101349G1022氨基G18252组G6116，其G8975性中心G11013氨基G18252G5219G2027中3236位的5G1022氨基G18252组G6116（TP5），位于G989G13512立体G12366间结G7512的G1881部，因此口服给药时可以G1825G19512G9052G2282酶的G1207G16886。G13792TP5作为胸腺生G6116G13044的G8975性中心，G1177G110135G1022氨基G18252组G6116，G8821有立体结G7512的G1457G6264作用，因此TP5口服给药无效，可被肠道G9052G2282酶迅速G1207G16886G13792G3845G8975。TP5G1032G5214G5224用制剂均为G8892G4568用粉G19036剂，TP5G13475G8892G4568给药其G15892G8986G2334G15940G7411G1177为30S，G15892G8986TCL分析及用G13920电法分析G18129G5483G2052G11468同的结G16782。为了G6564高TP5生物稳定性可G17839行G2282G4410结G7512G1474G202927,8、加入酶抑制剂9,10、改变给药G17896G546411,12G6122制备适宜的给药系统13,14以G3698加其酶稳定性G6122G6564高G2572G6922度。G7424研究系统考察了TP5的胃肠道酶降解机制，表G7138TP5在胃液中稳定，但在肠液中很G5567降解，具有浓度依赖性、PH依赖性和部位依赖性，并G17839一G8505G19428G7138了TP5可被G1881肽酶和外肽酶G6164降解，降解速率为胰蛋白酶羧肽酶氨肽酶胃蛋白酶G301糜蛋白酶。G16825研究对于研制G994开发TP5口服给药系统具有G18337G16213的作用。参考文献1KLEINERTHDDISCOVERYOFAPEPTIDEBASEDRENININHIBITORWITHORALBIOAVAILABILITYANDEFFICACYJSCIENCE,1992,257,194019432KESISOGLOUF,PANMAIS,WUYHNANOSIZINGORALFORMULATIONDEVELOPMENTANDBIOPHARMACEUTICALEVALUATIONJADVDRUGDELIVREV2007,59,6316443AGNIHOTRISA,MALLIKARJUNANN,AMINABHAVITMRECENTADVANCESONCHITOSANBASEDMICROANDNANOPARTICLESINDRUGDELIVERYJJCONTROLRELEASE,2004,100,5284THANOUM,VERHOEFJC,JUNGINGERHEORALDRUGABSORPTIONENHANCEMENTBYCHITOSANANDITSDERIVATIVESJADVDRUGDELREV2001,52,1171265HEIZMANNJ,LANGGUTHP,BIBERAENZYMICCLEAVAGEOFTHYMOPOIETINOLIGOPEPTIDESBYPANCREATICANDINTESTINALBRUSHBORDERENZYMESJPEPTIDES,1996,177108310896GONSERS,WEBERE,FOLKERSG,ETALPEPTIDESANDPOLYPEPTIDESASMODULATORSOFTHEIMMUNERESPONSETHYMOPENTINANEXAMPLEWITHUNKNOWNMODEOFACTIONJPHARMAACTA9HELVE,1999,736265737DEGRAWJL,ALMQUISTRG,HIEBERTCK,ETALSTABILIZEDANALOGSOF