饲料原料中黄曲霉毒素检测方法标准编制说明（2）

1饲料原料中黄曲霉毒素检测方法标准编制说明一、项目来源我所于2012年向省质量技术监督局申报了“饲料原料中黄曲霉毒素含量的测定高效液相色谱法”地方标准研制项目上，同年3月获贵州省质量技术监督局批准。项目单位成立了项目研究小组。二、项目概述本标准拟建立配合饲料、浓缩饲料、饲料原料玉米、饲料用干草（谷草）、饲料用青贮饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2单个或多个组分含量的高效液相色谱测定方法。通过研究国内外相关文献，了解到黄曲霉毒素M1及M2为动物代谢物，不作为饲料霉菌毒素污染物；同时，国家质量监督检验检疫总局于2014年7月8日发布了GB/T309552014饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化高效液相色谱法，该标准的适用范围是饲料，没有包含饲料原料及饲料用干草（谷草）、饲用青贮饲料等，因此我们将本项目研究的主要内容调整为饲料原料玉米和饲用干草料、青贮饲料等秸杆饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量测定方法的研究。本方法主要针对两类饲料原料进行研究。一是籽实类（玉米）；另一种是饲草秸杆类。由于两种物料密度差异较大，因此我们采用了两种提取处理技术进行样品前处理。籽实类（玉米）供试样品经2粉碎混匀，用甲醇水溶液提，用水调整极性后经免疫亲和固相萃取柱净化，供高效液相色谱仪测定；饲草秸杆类供试样品经粉碎混匀，用乙腈提取，离心分离，用PBS缓冲溶液整极性后经免疫亲和固相萃取柱净化，供高效液相色谱仪测定。本方法采用外标法定量。黄曲霉毒素B1、G1检测限为06G/KG，黄曲霉毒素B2、G2检测限为018G/KG。黄曲霉毒素B1、G1浓度在020100NGML、黄曲霉毒素B2、G2浓度在006300NGML范围内与标准溶液峰面积呈良好的线性关系（R0999）。平均加标回收率为7131098，测定结果批内相对标准偏差范围为085131，批间相对标准偏差范围为597129N6。该方法简便、准确，各项技术指标均满足国内外有关饲料中黄曲霉毒素的检测要求，可用于饲料原料玉米、饲料用干草（谷草）、饲用青贮饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2单个或多个组分含量分析测定。关键词饲料原料（玉米、秸杆、干草）；高效液相色谱；黄曲霉毒素1前言黄曲霉毒素（AFLATOXIN），是一种有强烈生物毒性的化合物，常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的谷物和饲草料中产生，如玉米、秸杆、豆类等。黄曲霉毒素是目前已知最强的致癌物质，其毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，当人摄入量大时，可发3生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生；当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生，其中又以B1毒性最大。黄曲霉毒素的主要分子型式含B1,B2,G1,G2,M1,M2等，其中M1和M2是黄曲霉毒素B1和B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素具耐热性，加热至280以上才开始分解，所以一般的加热不易破坏其结构。由于黄曲霉毒素对人和动物的严重危害，许多国家、地区已对其在粮食和饲料中的残留限量作了严格的规定。欧盟等国在2002年对粮食、花生及其制品中的黄曲霉毒素限量标准进行了修订，规定黄曲霉毒素B1的残留量2GKG，黄曲霉毒素总量（B1B2G1G2）4GKG。我国的饲料卫生标准GB130782001中也对黄曲霉毒素B1在各种饲料及饲料原料中的含量进行了限定。如玉米50GKG，奶牛精料补充料10GKG。目前我国有四个与饲料相关的黄曲霉毒素检测标准，详见表一。表1饲料中黄曲霉毒素检测标准标准名称适用样品黄曲霉毒素检测类型检测方法特点GB/T83812008饲料中黄曲霉毒素B1的测定半定量薄层色谱法单一饲料配合饲料AFB1半定量薄层色谱速度慢定量准确度低GB/T174802008饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法饲料原料配合饲料浓缩饲料AFB1半定量酶联免疫吸附法速度快定量准确度低4NY/T20712011饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T2毒素的测定单一饲料配合饲料浓缩饲料添加预混料AFB1、AFB2AFG1、AFG2定量定性高效液相色谱串联质谱联用法定量定性准，仪器成本高（250万RMB以上）GB/T309552014饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化高效液相色谱法饲料AFB1、AFB2AFG1、AFG2定量定性高效液相色谱法定量定性准从上述四种方法看，能准确进行定量检测的只有高效液相色谱串联质谱联用法和免疫亲和柱净化高效液相色谱法两种，但这两种方法都不能有效地对饲用草料秸杆等饲草料进行黄曲霉毒素的定量检测，虽然NY/T20712011可对单一饲料进行检测，但该方法采用的是高效液相色谱串联质谱仪进行检测，与我们研究采用的仪器方法不一样。该方法设备投入成本高、操作条件要求高，不适宜在我省推广。同时，我省农牧业生产又把牛羊列为发展的重点，如果没有一套有效的监测技术对牛羊饲草料进行质量检测控制，势必制约我省牛羊产业的发展，增加肉、蛋、奶产品质量安全隐患，危害人民生活质量安全。因此，十分有必要针对我省农牧业生产发展的现实状况和产品质量检测机构设备配套情况制定一套有效的定量检测方法标准。结合我省大部分检测机构都有高效液相色谱用仪的实际情况，我们拟建立一套采用高效液相色谱仪测定饲料原料中黄曲霉毒素含量的方法，以满足我省实际检测工作的需要。52实验部分21仪器与设备高效液相色谱仪美国WATERS2695、日本岛津LC10ADVP；色谱柱美国THERMOBDSHYPERSILC18柱、美国WATERSXBRIDGEC18柱，规格均为柱长250MM，内径46MM，粒度5M；高速离心机10000R/MIN，3K15，德国SIGMA公司；水平振荡器GFL3005，德国GFL公司；涡旋混合器MINISHARK3，德国IKA公司；固相萃取装置美国THERMO；光化学衍生器北京华安麦科生物技术有限公司。22试剂与材料甲醇色谱纯，德国MERCKKGAA；乙腈色谱纯，德国MERCKKGAA；黄曲霉毒素总量免疫亲和固相萃取柱3ML，北京华安麦科；滤膜045M；黄曲霉毒素标准品纯度99。23黄曲霉毒素标准溶液标准储备液（100G/ML）准确称取10MG黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2对照品，用50甲醇水溶液溶解并定容于100ML容量瓶中，分别配制成100G/ML的标准储备液。4下保存，有效期为3个月。混合标准中间液分别准确吸取适量的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准储备液，用50甲醇水稀释为含黄曲霉毒素B1、G1浓度为100NG/ML、黄曲霉毒素B2、G2浓度为30NG/ML的混合标准中间液。4下保存，有效期为3个月。6混合标准工作液准确吸取适量的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准中间液，用50甲醇水稀释为含黄曲霉毒素B1、G1浓度为020、050、100、200、500、100NG/ML、黄曲霉毒素B2、G2浓度为006、015、030、060、150、300NG/ML的混合标准溶液。4下保存，有效期为2周。由于霉菌毒素毒性很强，试验人员应注意自我保护。操作时,应避免吸入、接触霉菌毒素标准溶液。配置溶液应在通风橱内进行，工作时应戴眼镜、穿工作服、戴医用乳胶手套。凡接触霉菌毒素的容器，需浸入1次氯酸钠溶液，过夜后清洗。同时，为了降低接触霉菌毒素的机会，可直接购买并使用霉菌毒素的有证标准储备液。3前处理方法的选择31提取311称样量及提取液体积的选择（物料比）从目前检测方法看，称样量与提取液是影响提取的关键技术之一。现有的饲料黄曲霉毒素检测方法中，称样量及提取液体积如下表表2各标准中黄曲霉毒素提取物料比标准名称称样量提取液物料比GB/T83812008饲料中黄曲霉毒素B1的测定半定量薄层色谱法50G25G硅藻土、25ML水、250ML三氯甲烷16GB/T174802008饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法5G25ML50甲醇157GB/T309552014饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化高效液相色谱法50G100ML80甲醇12NY/T20712011饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T2毒素的测定5G25ML84甲醇15由于饲料原料种类繁多、性质特异，经我们反复实验比较，得到了提取关键技术的物料比关系。即对饲料原料玉米称样量为5G，物料比为16；对于干草、青贮饲料等秸杆（低密度）饲料原料，只有当物料比不低于110时提取液才能完全浸湿样品，因此设定称样量为3G，提取液为30ML，物料比为110。312提取液选择目前国家标准及各文献的报道中，提取液主要为甲醇水溶液及乙腈、乙腈水溶液。我们对此三种提取液进行了理论分析及实验比较。甲醇水溶液提取液由上表知2个国家标准及1个行业标准都采用了甲醇溶液作为提取液，浓度分别为50、80、84，这是由于黄曲霉毒素易溶于甲醇。本方法对不同浓度甲醇提取液的提取效果进行了考察。称取玉米样品5G、添加5NGAFB1；干草样品3G、青贮饲料样品3G，各添加3NGAFB1于50ML离心管中，准确加入不同浓度甲醇提取液30ML，涡旋提取5MIN，4000R/MIN离心5MIN，玉米样品8准确取6ML上清液（干草、青贮饲料样品准确取10ML上清液），加入一定量的水调整溶液极性后过免疫亲和柱，1ML甲醇洗脱，过045M滤膜后上机测定，实验分析结果见下表表3甲醇溶液提取剂回收实验结果表提取液理论上机液浓度（NGML）实测上机液浓度（NGML）回收率（）50甲醇1092292260甲醇1092792780甲醇10931931玉米84甲醇1092492450甲醇1039439460甲醇1037737780甲醇10468468干草84甲醇1045945950甲醇1019419460甲醇1017717780甲醇10168168青贮饲料84甲醇10159159由表3可知，甲醇溶液对玉米中黄曲霉毒素的提取液效果理想，且浓度从5084得到的回收率非常接近，无明显差异；甲醇溶液对干草、青贮饲料中黄曲霉毒素的提取回收率低，不能满足实验要求。为此，我们对乙腈、乙腈水溶液进行实验，以寻找合适的提取液。9乙腈提取液分别用50、60、80、100浓度的乙腈溶液作为提取液，同上法实验，实验分析结果见下表表4乙腈溶液提取剂回收实验结果表提取液理论上机液浓度（NGML）实测上机液浓度（NGML）回收率（）50乙腈1091591560乙腈1092492480乙腈10929929玉米100乙腈1091691650乙腈1060760760乙腈1065165180乙腈10728728干草100乙腈1081981950乙腈1050350360乙腈1060160180乙腈10700700青贮饲料100乙腈10815815由表4可知，乙腈溶液作为提取液也能有效的提取出玉米中的黄曲霉毒素，而在干草、青贮饲料样品中，100乙腈提取效果优于50、60乙腈及80乙腈。根据以上实验，甲醇溶液和乙腈溶液都能有效提取玉米等普通饲料原料中黄曲霉毒素，二者相比，对干草等饲草原料而言，乙腈能有效提取干草等低密度饲料原料中黄曲霉毒素，故本方法采用10100乙腈溶剂作为低密度饲料原料提取液。通过对不同提取液的研究比较，表明国标（GB/T309552014）方法中提取液不适用于干草料、青贮料样品，不能有效地进行提取，也即说国标方法（GB/T309552014）不适用于干草料、青贮料样品的检测。考虑到提取液毒性对实验员危害和提取效果，我们最终选择甲醇溶液作为饲料原料（玉米）提取液、乙腈溶液作为饲料原料（干草料、青贮料）的提取液。32净化本方法采用了免疫亲和柱净化样品，免疫亲和柱是一种利用抗原抗体特异性可逆结合特性的SPE技术，根据抗原抗体的高选择性，从复杂的待测样品中提取目标化合物。主要原理是将抗体与惰性微珠共价结合，然后装柱，将抗原溶液过免疫亲和柱，而非目标化合物则沿柱流下，最后用洗脱缓冲液洗脱抗原，从而得到纯化的抗原。本方法净化过程如下将50ML注射器针筒用固相萃取转接头固定在已恢复至室温的免疫亲和固相萃取柱上，取调整极性后的备用液上柱，去掉免疫亲和固相萃取柱下方堵头，调节固相萃取装置，使液体以12滴/秒的速度流出，待液体排干后，用10ML水润洗玻璃试管，用该润洗液洗涤小柱，挤干，1ML甲醇洗脱，收集洗脱液，过045M滤膜后，供高效液相色谱仪测定。33液相色谱条件11331玉米（干草料）液相条件色谱柱C18（25046MM，5M），或相当者；光化学衍生器连接在色谱柱与检测器之间；流动相甲醇水（3070）；流速10ML/MIN；柱温40；进样量20L；激发波长360NM；发射波长450NM。332青贮料液相条件色谱柱C18（25046MM，5M），或相当者；光化学衍生器连接在色谱柱与检测器之间；流动相甲醇水（4555）；流速08ML/MIN；柱温30；进样量20L；激发波长360NM；发射波长450NM。4结果与分析41色谱图12图1050NG/ML黄曲霉毒素B1、G1，015NG/ML黄曲霉毒素B2、G2标准溶液色谱图图2干草空白样品色谱图图31G/KG（03G/KG）干草添加样品色谱图13图4玉米空白样品色谱图图51G/KG（03G/KG）玉米添加样品色谱图图6050NG/ML黄曲霉毒素B1、G1，015NG/ML黄曲霉毒素B2、G2标准溶液色谱图14图7青贮饲料空白样品色谱图图81G/KG（03G/KG）青贮饲料添加样品色谱图42、标准溶液的线性关系考察配制黄曲霉毒素B1、G1浓度为020、050、100、200、500、100NG/ML、黄曲霉毒素B2、G2浓度为006、015、030、060、150、300NG/ML的混合标准溶液，依上述仪器条件测定，绘制标准曲线如下15图6黄曲霉毒素B1校正曲线图7黄曲霉毒素B2校正曲线16图8黄曲霉毒素G1校正曲线图9黄曲霉毒素G2校正曲线表5黄曲霉毒素线性关系表浓度范围（NG/ML）回归方程A值回归方程B值相关系数R2AFB10201008072098E23255900E4099985817AFB20063006198173E25230461E40999921AFG10201004095621E11864048E40999978AFG20063002406653E23400048E40999984由以上实验数据可知，本方法中4种黄曲霉毒素线性相关系数均大于0999，具有非常良好的线性。43、试验准确度及精密度考察准确度系指该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率（）表示；精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，一般以偏差（DEVIATION，D）、标准偏差（RELATIVEDEVIATION，RD）或相对标准偏差（RELATIVESTANDARDDEVIATION，RSD）表示。本标准制订中，分别对玉米、干草、青贮等饲料原料进行了考察。431、饲料原料（玉米）实验准确度及精密度考察将空白饲料原料（玉米）添加为黄曲霉毒素B1、G1含量100、500、1000G/KG、黄曲霉毒素B2、G2含量030、150、300G/KG的3组浓度阳性添加试料，各6个平行样，进行准确度及精密度考察，结果见表69表6饲料原料玉米中黄曲霉毒素B1准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）1000735073307200768076208070754754420500358355368370371377366732803227129181000960916940930904884922922292表7饲料原料玉米中黄曲霉毒素G1准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）1000707079307890753080507830772772468500372364381383381376376752193100084298486210081016900936936820821123表8饲料原料玉米中黄曲霉毒素B2准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）0300258024802770239025102670257856535150113116118118117119117780180300268310320258282320292973870931112表9饲料原料玉米中黄曲霉毒素G2准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）0300243025902300263024602650251837545150110111118120113117115767369300260266294286290260276920841569910由以上实验数据可知，在饲料原料（玉米）中4种黄曲霉毒素含量测定的准确度实验中，各浓度平均回收率范围为732977，准确度满足要求。19在精密度考察中，各浓度饲料原料（玉米）样品中4种黄曲霉毒素含量检测值的批内相对标准偏差RSD范围为180931，批间相对标准偏差RSD范围为910129，精密度满足要求。432、饲料原料（干草）实验准确度及精密度考察将空白饲料原料（干草）添加为黄曲霉毒素B1、G1含量100、500、1000G/KG、黄曲霉毒素B2、G2含量030、150、300G/KG的3组浓度阳性添加试料，各6个平行样，进行准确度及精密度考察，结果见表1013表10饲料原料（干草料）中黄曲霉毒素B1准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）1001031081041021041051041040198500507553530562551572549109843210008808849319138809379049041014291982表11饲料原料（干草料）中黄曲霉毒素G1准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）1001111141101081081051091090281500538539539530534529535107008510008889568959149408939149141025306940表12饲料原料（干草料）中黄曲霉毒素B2准确度及精密度实验结果20添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）03003180308030803160306031203091030198150141142142145143145143953118300280284273280253281275917967416597表13饲料原料（干草料）中黄曲霉毒素G2准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）03002860286031603080286031402999974961501601661531531621591591060322300278270261221228236249830962954124由以上实验数据可知，在饲料原料（干草料）中4种黄曲霉毒素含量测定的准确度实验中，各浓度平均回收率范围为8301098，准确度满足要求。在精密度考察中，各浓度饲料原料（干草料）样品中4种黄曲霉毒素含量检测值的批内相对标准偏差RSD范围为085954，批间相对标准偏差RSD为597124，精密度满足要求。433、饲料原料（青贮料）实验准确度及精密度考察将空白饲料原料（青贮料）添加为黄曲霉毒素B1、G1含量100、300、1000G/KG、黄曲霉毒素B2、G2含量030、090、300G/KG的3组浓度阳性添加试料，各6个平行样，进行准确度及精密度考察，结果见表111421表11饲料原料（青贮料）中黄曲霉毒素B1准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）1000780082708340792082208210813813265300244624572467246224612448245781903410008594876886868576864086348650865832080342表12饲料原料（青贮料）中黄曲霉毒素G1准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）1000843083808320834084108340837837050300254327212578262626342569261287124410009322915489008904895489129024902870194374表13饲料原料（青贮料）中黄曲霉毒素B2准确度及精密度实验结果添加值（GKG）测定值（GKG）平均值（GKG）回收率（）平均回收率（）RSD（）批间RSD（）030024202480247024902500244024782212509007000709071207110705071107087870663002492251825002506249824942502834814038300表14饲料原料（青贮料）黄曲霉毒素G2准确度及精密度实验结果添加值（GKG）