何水林版基因工程 第三章分子克隆载体.ppt

1、第三章 分子克隆载体（Molecular cloning vectors）,周毅峰 2013春,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。,载体(Vector),载体的本质是DNA。 经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineer

2、ing 第三章分子克隆载体,基因工程中常用的主要载体,质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒,噬菌体载体,柯斯质粒 (cosmid),单链DNA噬菌体M13,动物病毒,人工染色体 (artificial chromosome),2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,具有合适的

3、筛选标记,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,克隆载体 （cloning vector）,对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可,按功能分类,表达载体 （expression vector）,使目的基因在宿主细胞中表达，既有复制子，又有强启动子,穿梭载体 （shuttle vector）,可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表

4、达。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,第一节 质粒 （Plasmid）,质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106108D，可自身复制和表达。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括：,复制基因、选择性记、克隆位点。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1质粒的基本特性,2质粒DNA的分离纯化,4重要的大肠杆菌质粒载体,3质粒载

5、体的构建及类型,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.1质粒DNA的构型,两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，称为共价闭合环形DNA（cccDNA），通常呈现超螺旋的SC构型,只有一条DNA链出现有一至数个缺口，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型,线性分子DNA（IDNA），称为L构型,1 质 粒 的 基 本 特 性,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.2质粒DNA分子大小,2012年3月,基因工程中Gene E

6、ngineering 第三章分子克隆载体,1.3质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）的多少，质粒可分为两大复制类型：,严紧型质粒（stringent plasmid） 在宿主细胞中拷贝数少的质粒，1数个拷贝,松弛型质粒（relaxed plasmid） 在宿主细胞中拷贝数多的质粒，10个拷贝以上,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,低或单拷贝质粒的复制必需由复制子本身编码一个必不可少的顺式作用蛋白(repA)来对复制起点作正调控作用，如

7、psc101等，同时其复制受宿主蛋白合成的影响。所以这些质粒的拷贝数不能通过诸如氯霉素等蛋白质合成抑制剂来增加拷贝数,1） 松弛复制型,多拷贝质粒（pMB1或ColE1等）的复制不受宿主菌蛋白合成的影响的影响；当蛋白质合成不能进行时，复制依然进行,2)严紧型复制,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,How many copies can be replicated ?,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,Negative control,positive control,answers,Repressor

8、model: cop factor,Antisense RNA model: RNA,RNA,Rep protein,pMBl/colEl复制子,pSC101复制子,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA和RNA复制copies的调节,RNA由ori上游的550到下游的200转录出约为750nt的RNA,RNA由RNA基因反义链编码的108nt的RNA，与RNA互补, 控制复制引物与模板的结合,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA在RNaseH的作用下加工成550nt的成熟引物，起始复制,RNA5

9、端产生一个富含G的环与ori上游20bp处的富含C区互补,+150,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,此处复杂的RNA二级结构的正确折叠是复制起始的关键,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA与RNA互补后，不能起动复制,质粒复制依赖于宿主酶活性，一旦开始复制则不能自主控制自制速度和进程，故必须在复制启动前或启动时由RNA来控制,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA-1 0,When RNA-2,200-360Nt,Rom gene expressio

10、n, RNA- / RNA-D.S. repression,RNA- / RNA-,不能形成primer的 3-OH,促进,限 制,63 aa ROP (Rom protein),RNA- 只能转录到100-220 base, 不能到达“0”原点,不能形成primer 的3-OH,0,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,RNA和RNA之间“亲吻复合物”的放大。 由RNAI和RNA形成稳定的复合物通过抑制RNA与DNA稳定杂交体的形成而阻止DNA合成。,与Rom/Rop二聚体蛋白结合，使RNA I与RNAll形成稳定的“亲吻”复合物。,Rom RNAm

11、odulator(调节器) Roprepressor of primer,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,质粒载体及其拷贝数,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利

12、用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。,1.4质粒的不相容性,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,不相容性的质粒组成不相容性群,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,质粒的不相容性：分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种,拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，,两种含有不同

13、复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的,拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，,因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一,细胞内,其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.5质粒DNA的转移,G细菌质粒,接合型的质粒（conjugative plasmid）,非接合型的质粒（non-conjugative plasmid）,接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到,另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等,如Col、R的其它成员,非接合型质粒 不能在天然条件下独

14、立地发生接合作用,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,F质粒,大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子（fertility factor）或性因子（sex factor）决定的F因子，具有这种因子的能育品系记为F，相当于雄性。不含这种致育因子F的品系记为F，相当于雌性。,F+细胞的F因子通过接合管向F细胞转递 使F变成F，F因子还可改变细胞表面的构造，以防F细胞间的接合。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,R质粒 也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受

15、体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,Col质粒： 此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.6 携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DN

16、A重组分子的筛选具有重要意义,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,按其用途可将标记基因分为,选择标记基因,筛选标记基因,用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来,可用于将特殊表型的重组子挑选出来。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.6.1 选择标记,氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）,四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene, tetr）,氯霉素抗性基因（chloramphenicol re

17、sistance gene, Cmr, cat）,卡那霉素和新霉素抗性基因 （kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）,琥珀突变抑制基因 supF,蔗糖致死基因 SacB,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体, 氨苄青霉素抗性基因 （Ampicillin resistance gene, ampr）,氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。,2012年3月,基因工程中G

18、ene Engineering 第三章分子克隆载体,四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。, 四环素抗性基因 （Tetracycline resistance gene, tetr）,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体, 氯霉素抗性基因 （chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）,氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白

19、质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬菌体（也携带 Tn9）。 cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体, 卡那霉素和新霉素抗性基因 （kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）,卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶

20、（APH（3）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变（突变为 UGA）

21、。 supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。, 琥珀突变抑制基因 supF,如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。,supE 基因在 UAG 密码子上编译谷氨酰氨。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefa- ciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。, 蔗糖致死

22、基因 SacB,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.6.2 筛选标记基因,筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒 当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,乳糖操纵子（lac operon）,大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码 -半乳糖苷酶（-galactosidase），如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。, -互补（-complementation）,20

23、12年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,lacZ：只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因 ，其产物也没有酶学活性。,lacZM15 基因是缺失了编码 -半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。,当这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复 -半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,在 lacZ编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响 -半乳糖苷酶的功能内互补。 若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不

24、可避免地导致产生无-互补能力的 -半乳糖苷酶片段。,利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,异丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为 lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,乳糖既是 lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物，乳糖及其衍生物可诱导lacZ 表达。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-g

25、al） 可作为 lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。 底物 X-gal 还可充作生色剂，被 -半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,-互补：载体带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，该区段编码 半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成） N端的一个片段。IPTG诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型 半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补）。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因

26、工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,插入失活 (insertional inactivation),外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活(insertional inactivation)。,插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体，例如若在质粒pBR322的BamHI的位点插入外源DNA，然后转化大肠杆菌(Tets、Amps)。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,有重组质粒(即带有外源DNA的质粒)的宿主细胞失去对四环素的抗性，

27、所以不能在含有四环素培养基的平板上生长，但仍能在含有氨苄青霉素培养基的平板上生长。而那些含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，则可以在含有四环素或氨苄青霉素培养基的平板上生长，这样就很容易筛选到含有目的基因的细菌，从而淘汰不含目的基因的细菌。,2质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,质粒DNA的分离纯化,氯化铯密度梯度离心法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙

28、锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,质粒DNA的分离纯化,碱溶法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,用无DNase的RNase去除残余的RNA,质粒DNA的分离纯化,沸水浴法：,用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒钟,离心，

29、用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,3质粒载体的构建及类型,3.1天然质粒用作隆载体的局限性,天然质粒：一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和pSC101等,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,现行通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改建而成的。一般说来，一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件：,(i) 具有复制起点,(ii) 具有抗菌素抗

30、生基因,(iii) 具若干限制酶单一识别位点,(iv) 具有较小的分子量和较高的拷贝数,3.2质粒载体必须具备的基本条件,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,3.3不同类型的质粒载体,高拷贝数的质粒载体,适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。,低拷贝数的质粒载体,适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。例如，pLG338、pLG339及pHSG415。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,失控的质粒载体,失控的质粒载体（runaway plasmid vect

31、ors）：是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。,B.E.Uhlin等人（1979）首先发展了失控的质粒载体pBEU1和Pbeu2。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,插入失活型的质粒载体,选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。,正选择的质粒载体,正选择质粒载体（direct selection vectors）：这种质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型

32、。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,表达型的质粒载体,使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,4.1pBR322质粒载体,pBR322质粒载体的

33、构建(p93),由F.Bliver和R.L.Rodriguez构建,4重要的大肠杆菌质粒载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,pBR322质粒的三个不同来源的组成部分,pBR322质粒载体的优点,pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）,pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）,ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,pBR322质粒载体优点主要表

34、现在以下几个方面：,具有较小的分子量，pBR322质粒DNA分子为4 363bp。,具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。,具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积10003000个拷贝。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,4.2 pUC质粒载体,pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。,pUC质粒载体的结构,包括pUC7、8、9、12、1

35、3、18、19、118、119等,（i）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；,（iii）大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；,（iv）位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Ge

36、ne Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,（2）pUC质粒载体的优点,如pUC8为2 750bP，pUC18为2686bP。 pUC8质粒平均每个细胞即可达500700个拷贝。,具有更小的分子量和更高的拷贝数,重组体 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，在应用pUC8质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。,适用于组织化学方法检测,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三

37、章分子克隆载体,pUC8质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。,具有多克隆位点MCS区段,因此，克隆在MCS当中的外源DN片段，可以方便地从pUC8质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核着酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC8质粒载体上。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,4.3 T载体与TA克隆方法,TA克隆方法（Original TA Cloning Kit

38、）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3端自动添加一个3-A突出端。,T载体：一个线性含3-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。,Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,第二节 病毒（virus）,质粒载体携带的外源基

39、因限于以下 构建基因组文库时，目的DNA10kb，应采用病毒载体。,病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞（转导）,然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,大肠杆菌的 噬菌体DNA衍生的载体,黏性质粒载体：

40、含有 噬菌体DNA的某些位点并被包装而获得的载体,M13：小分子的丝状单链噬菌体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1 噬菌体,1.1l 噬菌体的生物学特性： 生物结构,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.1.1l 噬菌体基因组结构,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,The phage cos ends： cos位点

41、（cohesive-end site，粘性末端位点 ）,在噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,占噬菌体 DNA 4050% ，裂解生长所必须,右臂约为 8-10kb ，从 PR 启动子到右侧 cos 位点。,左臂约 20kb ，从基因 A 至基因 J 的区域，含有编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因, 噬菌体基因组至少可编码 50 个基因，它们的分布和排列与其功能有一定关系。根据执行功能可将基因组分为三个区。,2012年3月,基因工程中Gen

42、e Engineering 第三章分子克隆载体, 噬菌体的可取代区（中间区或非必需区）,J 基因与 Cro 基因之间的 DNA ，占噬菌体 DNA 的 1/3 ，主要包含控制噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因。,可被 ga1 基因或 bio 基因替换，不影响 噬菌体裂解生长。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,DNA,Protein coat,cos,cos,Nonessential region,Long (left) arm,short (right) arm,Exogenous DNA (20-23 kb),12bp, phage,201

43、2年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.1.2l 噬菌体生命周期与溶原状态,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,整合主要由-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。,噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。,DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态,人们可以根据需要改变-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态,2012年3月,基因工程中Gene

44、 Engineering 第三章分子克隆载体,1.2l 噬菌体的选择性标记,lacZ 基因也可用于 噬菌体载体，通过插入或替换载体中的 -半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。, lacZ 基因,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,c基因,c编码的抑制子与操纵区 OR1 和OR2发生亲和作用结合后，激活PRM启动 c 表达抑制子，结合Cro及下游裂解蛋白基因的表达，抑制裂解生长,溶原,裂解,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,hfl-的 E.coli 中，c

45、 的表达使 噬菌体进入溶源状态,hfl+的 E.coli 中，噬菌体可高效率地进入溶源状态,Hfl：高频溶源化， high frequency of lysogenization,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,重组子中外源基因插入到c 中，c不能表达,将高频率地使 hfl -E.coli 进入裂解生长状态，长出噬菌斑。,在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。,Some of phage plaque,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,c 基因,在hfl

46、 E.coli中增加基因 c 的产物，高效地进入溶源状态,c产物(c)结合PRE激活c的表达，生长向溶原方向进行,重组子中外源基因插入到c 中，c不能表达，将高频率地使 hfl -E.coli 进入裂解生长状态，长出噬菌斑。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,Spi 筛选,野生型 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感（sensitive to P2 interference）。,Spi+,如果 噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam ，同时带有 ch

47、i 位点，并且宿主菌为 rec + ，则可以在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好，噬菌体的这种表型称作 Spi- 。,Spi-,因此，通过噬菌体载体 DNA 上的 red 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.3l 噬菌体载体构建,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时（包装范围为原DNA的75 - 105%） ，

48、才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。,因此，缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。 野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。,根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.3.1 插入型载体（insertion vectors）,只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。,外源的DNA克隆到插入型的载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。,-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlon of E.coli -galactosidase）,

49、免疫功能失活的（inacti- vatiort of immunityfunction）,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,免疫功能失活的（inacti- vatiort of immunityfunction）,基因组中有一段免疫区（c），有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上，不能进入溶源周期。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,turbid plaques,clarification plaques,带有外源DNA插入的重组体形成清晰的噬菌斑（clarificatio

50、n plaques）,没有外源DNA插入的亲本噬菌体形成混浊的噬菌斑（turbid plaques）,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlon of E.coli -galactosidase）,基因组中lacZ区段，编码着半乳糖苷酶，由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。,如果外源DNA插入到lacZ区段上，阻断了-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。,2012年3月,基因工程中Gene Engine

51、ering 第三章分子克隆载体,插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb左右）的外源DNA片段的插入，应用于cDNA及小片段DNA的克隆。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代,1.3.2 替换型载体（replacement vectors）,替换型载体又叫做取代型载体（substitution vector），是一类在噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。,2012年3月,基因工程中Gene Engineer

52、ing 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,NM781载体中，可取代的EcoRI片段编码有一个supE基因，可抑制寄主细胞lacZ基因的琥珀突变， NM781感染写宿主后能在乳糖麦康基氏（Macconkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。,NM781,如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,NM781感染写宿

53、主后能在乳糖麦康基氏（Macconkey）琼脂培养基上产生红色的噬菌斑,重组NM781感染写宿主后能在乳糖麦康基氏（Macconkey）琼脂培养基上产生无色的噬菌斑,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,对重组体的DN A分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体。,用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：,应用适当的核酸内切限制酶消化载体，除去基因组中可取代的DNA区段,DNA臂同外源DNA片段连接。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,替换型载体克隆外源DNA可能出现三种情况,2012年3月,基因工程

54、中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,替换型载体可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA,最小装载长度 10 kb,最大装载长度 25 kb,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.4重组体DNA分子的转染作用与体外包装,1.4.1重组体DNA分子的转染作用,用重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染（transfection）,野生型 DNA典型转染效率为 105106之间 体外连接的结果，转染效率便下降到了104103左右。,

55、转染效率：每微克DNA转染产生的噬菌斑数目,DNA的转染作用，是一种低效的过程。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.4.2DNA的体外包装,DNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体,噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,体外互补作用研究

56、,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.4.3噬菌体DNA的包装限制问题,上限不得超过其正常野生型DNA总量的5左右,噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。,下限不得少于正常野生型DNA总量的75,噬菌体的包装上限是 51kb。 编码必要基因的DNA区段占28kb,因此，载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb,按野生型DNA分子长度为 48kb计算,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,gateway,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,1.5l

57、-DNA及其重组分子的分离纯化：,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时,用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒,密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放l-DNA,乙醇或异丙醇沉淀l-DNA,1.5l-DNA作为载体的优点：,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适

58、合表达,外源基因,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,3柯 斯 质 粒 载 体,是一类由人工构建的含有 DNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体（cosmid vectors） 。,柯斯质粒（cosmid）,1978年，JCoffins及BHohn等人发展出柯斯质粒载体。,“cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组

59、DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒,1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,装载范围为31 - 45 kb,考斯质粒载体的特点：,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,不能体内包装，不裂解受体细胞,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,2012年3月,基因工程中Gene Engineering 第三章分子克隆载体,柯斯克隆,应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmid cloning）,线性噬菌体DN分子末端cos位点，在噬菌体的正常生命周期中，会产生由数百个DNA拷贝组成的多连体分子。,末端酶（terminase）或Ter体系：噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specific cutting system），