探讨肺炎链球菌候选疫苗蛋白SPD0295的重组表达

1、探讨肺炎链球菌候选疫苗蛋白SPD0295的重组表达 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S. pn)是引起细菌性肺炎、中耳炎、菌血症及脑膜炎等的主要致病菌，其在世界范围内有较高的致病率与死亡率，尤其是对婴幼儿及老年人存在高致病性。目前，市售的S. pn 疫苗主要有2 大类， 一类是以23 价S. pn疫苗为代表的多糖疫苗，存在免疫原性和诱导非T 细胞依赖性免疫反应弱、对老年人及2 岁以下儿童保护效果差等诸多缺点。而另一类则是以PCV7 为代表的结合疫苗，在使用过程中存在荚膜血清型转换、价格昂贵等缺点;目前发现的93 种S. pn 血清型中，PCV 疫苗覆盖面极为有限

2、，不能产生广泛的保护效应。因此，开发成本低、免疫原性好、保守性高的S. pn蛋白疫苗，促进S. pn 疫苗更新换代显得尤为必要。磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸酶转移系统(thephosphoenolpyruvate dependent phosphotransferasesystem，PTS)由非特异性酶I(Enzyme I，EI)、热稳定组氨酸蛋白(histidine protein，HPr) 和对糖有特异性的酶II (Enzyme II，EII) 组成。该系统在多种革兰阳性菌中具有转运碳源、趋化效应、磷酸化作用以及对其它代谢通路的调节作用。其中EII 由EIIA、EIIB 及EIIC 组成， 而

3、SPD0295 是肺炎链球菌EIIB 的核心组分，其对碳源具有特异性转运功能，可能是潜在的候选疫苗靶点， 而目前国内外关于该蛋白的研究很少。因此，本研究拟探讨SPD0295 重组蛋白的抗原性、其在不同S. pn 菌株中的保守性及其对肺炎链球菌的黏附抑制效应，为S. pn 蛋白疫苗的开发提供初步理论依据。1 材料与方法1.1 实验材料所用68 周龄、体质量1820 g 的雌性Balb/c 小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，并负责长期饲养。NCTC7466(D39)、TIGR 4 型S. pn标准菌株购自欧洲国家标准菌种库;CMCC(B) 31693(serotype 19F)、CMCC (B)

4、31446 (serotype 4)、CMCC(B)31614 (serotype 14)、CMCC (B) 31207 (serotype 6B)、CMCC(B) 31436 (serotype 3) 等临床菌株，均由中国医学细菌保藏管理中心提供;pET28a、E. coli DH5α、E.coli BL21(DE3)均由重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室长期保存;A549 细胞株由重庆医科大学生物工程系提供。基因组DNA 抽提试剂盒、DNA 纯化试剂盒和Prime-Star 高保真DNA 聚合酶，限制性内切酶EcoR及Xho均由TaKaRa 公司提供;DNA marke

5、r 从上海生物工程公司购进;6×His 标签抗体、HRP 标记羊抗鼠IgG 抗体，均从北京中杉公司购进;质粒抽提试剂盒为美国Omega 公司提供;T4-DNA 连接酶为美国Promega 公司产品;硫代半乳糖苷为美国Sigma 公司产品、铝佐剂为美国Pierce 公司产品;His-Bind Column (Ni-NTA) 树脂为美国GE 公司产品。1.2 目的基因扩增-80 冰箱取出S. pn D39 标准菌株，室温复苏后取少量加于C+Y 培养基中，37 增菌培养至细菌生长到对数中、后期，按基因组DNA 抽提试剂盒说明书提取全基因组DNA，PCR 技术扩增spd0295 基因的开放

6、读码框架(约492 bp)。引物由上海生物有限公司合成，其中：上游引物P1：5′-GCCGGAATTCATGACAATGCCAAATATT-3′， 含EcoR酶切位点;下游引物P2：5′-GCGCTCGAGTTAAATATAGTCCATAATG-3′，含Xho酶切位点。扩增体系为:ddH2O 32.5 μl、5×buffer (含Mg2+) 10.0 μl、P1 (10 pmol/L) 1.0 μl、P2 (10 pmol/L) 1.0 μl、dNTP(10 mmol/L) 4.0 μl、S. pn 基因

7、组DNA 1.0 μl、Prime-Star 0.5 μl 共50 μl，扩增条件为：98 10 s、55 15 s、72 40 s，反应30 个循环;最后72 延伸10 min，取5.0 μl 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.3 重组质粒构建分别用EcoR及Xho对上述纯化后目的DNA 和pET28a 质粒进行双酶切， 酶切产物纯化后在T4-DNA 连接酶作用下连接16 h，然后转化提前制备好的感受态细胞DH5α， 铺于含Kana抗性的LB 平板，37 培养过夜。次日挑取单个菌落进行增菌培养，同时进行菌液PCR、双酶切鉴定和送金斯瑞公司进行测序鉴定。

8、1.4 目的蛋白的表达、纯化及鉴定将构建的SPD0295-pET28a(+)-E. coli BL21(DE3)，在含Kana抗性的LB 培养液中大量增菌(至A600 nm=0.6 时)，以0.3 mmol/L IPTG 诱导10 h， 收集菌体经超声破碎后离心留取上清， 再采用Ni-NTA 柱纯化目的蛋白，以SDS-PAGE 和BioRad 凝胶成像系统检测分析蛋白表达与提纯效果。超滤除盐的SPD0295 纯化蛋白，经Bradford 法定量，小量分装-80 保存(终质量浓度1 μg/μl)。上述蛋白经SDS-PAGE 电泳后， 转移至PVDF 膜;以His-tag 抗体为一抗(

9、1750 稀释)，羊抗鼠HRP-IgG 抗体为二抗(15 000 稀释)，DAB 为显色底物进行染色鉴定，以E. coli BL21(DE3)作为阴性对照。1.5 spd0295 基因保守性分析取国内流行的7 株不同血清型肺炎链球菌，在C+Y 液体培养基中进行增菌培养后，一部分用于DNA 模板的提取，一部分用于蛋白表达水平分析。以P1、P2 作为引物进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化后送上海生物工程有限公司测序， 然后对测序结果与BLAST 数据库DNA 序列进行比对，分析其保守性。1.6 SPD0295 蛋白在不同肺炎链球菌血清型中的表达上述增菌培养好的7 株不同S. pn 菌液， 离

10、心取沉淀物， 用PBS 重复洗涤3 次， 经1×Loading buffer充分重悬，于100 水浴10 min 裂解细菌;裂解产物经SDS-PAGE 电泳分离后转膜，以抗SPD0295 抗血清为一抗(11 000)，羊抗鼠HRP-IgG 为二抗(15 000)，DAB 为显色底物染色， 检测分析7 株不同型肺炎链球菌中SPD0295 蛋白的表达水平， 以金黄色葡萄球菌作为阴性对照。1.7 多克隆抗体的制备及效价分析将-80 纯化保存的目的蛋白与Alum 佐剂混匀(V/V=31，用前配制)。随机选择12 只Balb/c 小鼠作为实验组，分别于第0、14、28 天行腹腔注射免疫(每次

11、抗原用量10 μg/只，首次剂量加倍);平行选取12 只Balb/c 小鼠作为对照，以生理盐水及Alum 佐剂混合物经腹腔注射免疫。在末次免疫后第7 天，经尾静脉取血4050 μl，分离血清后ELISA 法检测其抗体效价。结果判定：在A450 nm处，抗血清最大稀释倍数孔的吸光度值达Alum佐剂组对应稀释孔的2.1 倍，稀释倍数的对数即判定为抗血清滴度。1.8 黏附抑制实验取适量A549 细胞株(II 型肺癌上皮细胞)经无菌培养至100%群集。抗原黏附抑制实验拟将SPD0295 蛋白抗原稀释至终质量浓度1.0 μg/ml 后， 加至培养的A549 细胞后37孵育1 h，用无菌

12、PBS 洗涤3 次， 加入1.0×106 CFU 的D39 肺炎链球菌后再次孵育1 h;再以无菌PBS 冲洗，收集各孔A549 细胞后经适当稀释再在血平板上培养过夜进行菌落计数;采用BSA 血清作为阴性对照。抗血清黏附抑制实验拟将培养的A549 细胞与PotD 抗血清(按1500 稀释)共同孵育30 min，加入1×106 CFU 的D39 肺炎链球菌，其余步骤同前。生理盐水与Alum 佐剂混合作为阴性对照，刺激小鼠后产生的特异性抗血清。所有黏附实验均重复3 次，记录D39 血清型S. pn 的黏附数量(CFU/well)。1.9 统计学分析用Graphpad Pris

13、m 5.01 软件分析，各组间比较采用Mann-Whitney U 检验，P<0.05 为具有统计学意义。2 结果2.1 重组pET28a - spd0295 载体的双酶切鉴定spd0295 基因扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，在约492 bp 处见清晰条带，其大小与目的片段吻合。重组质粒pET28a-spd0295 经双酶切(EcoR、Xho)后1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在约492 bp 处亦有清晰的目的条带。测序结果与GenBank 数据库中D39 型S. pn 菌株的spd0295 基因进行比对，序列完全一致。提示spd0295 重组质粒构建成功。2.2 SPD0295 重

14、组蛋白的表达分析IPTG 诱导后的细菌裂解物经SDS-PAGE 鉴定， 在相对分子质量(Mr)约18.0×103 处有清晰的条带出现，且主要以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA 柱纯化后，蛋白纯度达98%， 完全满足后续实验要求。纯化后的Gts 重组蛋白经Western blot 技术和染色分析鉴定显示明显条带， 提示该蛋白能与抗Histag 特异性结合。2.3 spd0295 基因保守性分析7 株临床常见血清型S. pn 中编码区大小与D39 菌株spd0295 基因完全一致，均为492 bp。该PCR 扩增产物经测序鉴定， 其基因一致性超过99.0%， 提示spd0295 基因

15、在这7 种血清型肺炎链球菌中存在高度保守性。2.4 SPD0295 蛋白在不同血清型S. pn 菌株中的表达情况不同血清型S. pn 菌裂解后上清经SDSPAGE电泳后转膜，以抗Gts 抗血清为一抗，羊抗鼠HRP-IgG 为二抗进行染色鉴定。7 株S. pn 菌在Mr约18 000 处均有特异性反应条带出现。2.5 ELISA 法检测多克隆抗体效价对照组几乎未产生特异性的lgG 抗体(效价0.081±0.007)，而实验组抗体效价高达6.78±0.46，2 组间比较有显著差异(P <0.001)。结果提示SPD0295 重组蛋白能激发小鼠产生极强的特异性抗原抗

16、体反应。2.6 细菌黏附抑制实验通过菌落计数方法，与BSA组比较，SPD029 重组蛋白能显著抑制D39 血清型S. pn 黏附于A549 细胞(P < 0.001);与阴性对照组比较，SPD0295 抗血清也具有相同效应(P < 0.001)。3 讨论S. pn 蛋白疫苗是当前研究的热点， 而作为疫苗蛋白需要有其特点： 密切参与S. pn 细菌的致病过程、在所有血清型S. pn 中具有较高表达水平， 是T细胞依赖性抗原、具有极高的免疫活性及可以激发婴幼儿产生极强的免疫记忆效应。此外，运用基因重组技术生产的蛋白疫苗也大大降低生产成本，显著减轻了广大发展中国家使用疫苗的沉重负担。目前，Audouy 等已在人体中用单一重组PspA 变体进行期临床试验证实这种疫苗能诱导针对异源PspA 分子的交叉反AXD应抗体，而且这些抗体能保护小鼠抵抗腹腔注射S. pn 的攻击。据文献报道，在S. pn 菌内鉴定的2 个PTS 系统均具有纤维二糖和蔗糖特异性，表明S. pn 在小鼠体内可以高效利用这2 种碳源，对其在体内存活起关键作用，且与其定植部位及生活方式密切相关，而目前关于SPD0295 蛋白方面的报道较少，甚至没有。故本研究以PTS 系统EIIB 中的核心组分SPD0295 为研究对象，经生物