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1、定量PCR实验故障排除,扩增曲线-v1.4,扩增曲线-v2.0,标准曲线-v1.4,标准曲线-v2.0,原始数据-v1.4,原始数据-v2.0,原始信号-v1.4,原始信号-v2.0,融解曲线-v1.4,融解曲线-v2.0,1 没有标准曲线,常见问题一：没有标准曲线,常见问题一：没有标准曲线,组分,扩增曲线,常见问题二：没有扩增曲线,光谱,原始数据只有1个循环,常见问题二：没有扩增曲线,原因1：PCR参数设置错误 数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。,常见问题二：没有扩增曲线,原因2：硬盘休眠，数据采集中断,常见问题二：没有扩增曲线,原因2：硬盘休眠，数据采集中断,常见问题二：没有扩

2、增曲线,7900,7500,常见问题三：基线不平滑,从原始数据找原因 1-9循环，ROX的信号下降，与试剂质量有关 基线设定4-13范围内，ROX信号值变化，FAM的信号值基本固定；FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线； 应该取ROX信号稳定的10-20循环为合理的基线范围。,常见问题三：基线下滑,修改基线范围为10-20，重新分析,常见问题三：基线下滑,基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的图谱；,常见问题三：基线下滑,原因：模板浓度高，基线的终点大于CT值 通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值 15，而基线范围仍然取3-15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高 解决

3、方法：减小基线终点至CT值前4个循环，重新分析数据,常见问题四：扩增曲线弯曲,原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。 解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；浓度太高的样品，需稀释后另做实验。,常见问题四：扩增曲线弯曲,常见问题五：直线扩增曲线,部分探针降解后，部分reporter从探针上脱落，导致：基线抬高；扩增与荧光信号的增加不一致。,常见问题六：V型扩增曲线,双击纵坐标，打开Graph Settings 关闭Y轴Auto Scale 设置到正常范围如0-12000,常见问题六：V型扩增曲线,扩增曲线是水

4、平直线 没有检测到信号升高提示没有扩增,常见问题六：V型扩增曲线,常见问题七：扩增曲线不光滑,如果信号10000点，就不会打折 弱的信号经过校正后，点与点之间的差异被放大,常见问题七：扩增曲线不光滑,解决方法 使用高质量的探针 补救方法：关闭ROX校正，重新分析数据,关闭ROX校正,常见问题七：扩增曲线不光滑,关闭ROX校正的效果,常见问题七：扩增曲线不光滑,常见问题八：重复性不佳,常见问题八：重复性不佳,原因：盖子未盖紧，溶液蒸发,常见问题八：重复性不佳,常见问题九：参比荧光,常见问题九：参比荧光设置不当,常见问题九：参比荧光设置不当,常见问题九：参比荧光设置不当,常见问题九：参比荧光设置不当,常见问题十：无柱状图,现象：扩增曲线正常，无基因表达结果（柱状图） 原因：软

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