细胞工程重点山

1、1、 消毒灭菌的方法、影响因素及不同种类物品培养基的灭菌方法（一）物理灭菌：高温灭菌法（干热、湿热）、过滤除菌法、射线灭菌法、超声波灭菌法（二）化学灭菌法： 消毒剂消毒法、抗菌素抑菌法（三）影响因素：消毒剂的性质浓度作用时间、微生物的种类数量、温度和酸碱度、有机物（四）不同种类物品培养基的灭菌方法：培养基湿热灭菌、器械器皿灼烧干热灭菌、不耐热物质过滤除菌、空间紫外线和熏蒸灭菌、物体表面药剂喷雾消毒、实验材料消毒剂消毒。2、植物培养基成分：水、无机元素（大量：CHONPJGaMgS；微量：FeCuMoZnNaMnCoB)、有机元素（氨基酸类、维生素类、肌醇、天然有机添加物类）、生长调节物质（生长

2、素类、细胞分裂素类、赤霉素类）、碳源和能源、琼脂、活性炭3、动物培养基成分：水、无机盐、微量元素、维生素类、缓冲系统、能源和碳源、氮源、激素和生长因子、添加剂4、动物培养基制备：天然培养基（血清、水解乳蛋白、胚胎提取液、胶原）、合成培养基、无血清培养基、平衡盐溶液（生理盐水、平衡盐溶液）5、植物细胞全能性及分化全能性：指植物体的每个活细胞都具有该植物的全套遗传信息，与合子一样具备发育成完整植株的潜能。分化：指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。细胞分化的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，

3、通过不同基因表达的开启或关闭，最终产生标志性蛋白质。脱分化：在某些条件下，分化了的细胞也不稳定，其基因表达模式也可以发生可逆性变化，又回到其未分化状态，这一过程称为去分化。再分化：指已经去分化形成的胚性细胞在某些刺激条件下(例如创面神经组织分泌的成纤维细胞生长因子诱导，以及创面产生的生物电流刺激等)，重新启动开始分化发育的过程。6、 植物细胞分化过程：诱导期、分裂期和分化期诱导期：又称启动期，是细胞分裂的准备期。分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期分化期：愈伤组织形成到器官发生时期7、 植物体细胞胚胎发生特点及发生途径（1） 特点：胚状体是离体培养的产物，也是有细胞脱分化产生的，因此胚胎发生

4、能力是培养的植物组织细胞具有的一个基本特征。胚状体起源于非合子细胞。胚状体发育过程和合子胚相似，经历球形期、心形期、鱼雷期和子叶期阶段。（2） 途径：直接从器官外植体上发生、愈伤组织发生、悬浮培养细胞发生、单倍体细胞发生、原生质体发生。8、 激素对胚状体发生的影响（1） 前期需要激素，后期不需要激素或需要极低浓度的激素： 生长素作用分为两个阶段：生长素对愈伤组织的诱导及胚胎发生丛的形成必不可少。 由于生长素浓度降低而提高了细胞分裂素与生长素的浓度比，迫使愈伤组织中的分生区细胞分裂，逐渐形成胚胎发育条件。 细胞分裂素与生长素浓度比低则促进胚胎细胞生长，若比值高则促进胚胎发育。 植物离体无性繁殖中

5、器官发生方式：不定芽型、器官型、器官发生型、胚状体发生型、原球茎发生型。9、 植物离体无性繁殖方法：母株制备、增值、植株再生及鉴定、炼苗和移植。10、 单细胞培养方法：细胞悬浮培养（分批、连续）：将植物游离细胞或极小的细胞团在液体培养基中进行培养看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增值的方法平板培养 微室培养11、 植物次生代谢物的工业生产：选材、高产细胞株系的筛选和建立、大量培育、有效成分的分离和提取。12、 突变体筛选方法：直接选择法（正选择法、负选择法）、间接选择法、绿岛法13、 脱分化培养方式选择：固体平板培养、液体培养、双层培养、分步培养、条件培养、看护培养、微

6、室培养。14、 植物原生质体（1） 原生质体培养目的：实现远缘物种体细胞杂交，使外源染色体、DNA或细胞器导入，创造新的远缘杂交。包括原生质体分离、培养、体细胞杂交、杂交细胞产生愈伤组织及再生植株。（2） 概念：指用特殊的方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生命力的原生质团。（3） 意义：单细胞无性系的建立、遗传转化的良好受体、多种基础研究的实验体系、体细胞杂交种的形成。（4） 原生质体分离方法：机械分离法、酶解分离法、（5） 纯化方法：离心沉淀法、漂浮法、界面法、（6） 活力测定：形态识别、荧光素二乙酸酯染色法、其他方法（伊凡蓝染色法、相差显微镜观察法、酚藏花红染色法）（7） 培养方法：液体浅层

7、培养法、平板培养法、固-液双层培养法、看护培养法（8） 再生过程：细胞壁再生、细胞分裂、植株再生16、 植物体细胞杂交（1） 原生质体融合方法：自然融合法、诱导融合法诱导融合法：化学融合 NaNO3融合法、高PH高浓度钙离子融合法、PEG融合法物理融合法：电融合法（2） 同合体、异合体、胞质杂交、胞质体 名词解释17、 细胞质杂种产生途径：一个正常原生质体和一个去核原生质体融合一个正常原生质体和核失活原生质体融合异核体形成后，两个核中一个消失较晚时期染色体选择性消除。18、 植物胚胎培养的应用：克服远缘杂交的不育性，获得稀有杂交物种；打破种子休眠，提早结实缩短育种年限；使生活力低下或无生活力的

8、种子萌发；是柑橘类植物合子胚正常发育；测定种子生活力；获得三倍体或单倍体植株；7快速繁殖特殊植物；用于理论研究。19、 植物胚乳培养的意义：在理论研究上课用于胚乳细胞全能性、生长发育和形态建成、胚和胚乳的相互关系、胚乳细胞生理生化机制等研究。此外胚乳对育种实践也有一定意义。（1973年，从罗氏核实木成熟的胚乳经过培养获得三倍体再生植株证实胚乳具有全能性）20、 植物离体授粉：指在无菌条件下，培养未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发进入胚珠，完成受精作用。21、 人工种子的概念和意义（1） 概念：指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的能发芽出苗的颗

9、粒体。（2） 结构：胚状体、人工种皮、人工胚乳（3） 意义：结构完整体积小，便于贮藏和运输，可直接播种和进行机械化操作 不收季节环境制约，数量多繁殖快利于工厂化生产 利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有的植物，也可以大量繁殖无病毒材料 可在人工种子中加入抗生素菌肥农药成分，提高种子活力和品质 体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。22、 病毒在植物体内的分布：老化和成熟组织及器官中病毒含量较高，幼嫩和未成熟的组织及器官中病毒含量较低，而在根尖茎尖生长点0.1-1mm区域几乎不含病毒。23、 植物脱病毒方法（1） 热处理脱毒法：热水处理、热空气处理、变温热处理（2） 茎尖培养脱毒法原

10、理：在一个植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间连丝，速度很慢，难以赶上活跃生长的茎尖；在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制；在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖。倘若在植物体内存在“病毒钝化系统”则在分生组织除活跃更高，因而分生组织不受侵染。步骤：茎尖的剥离：此步是技术关键，一般在解剖镜下操作。2-3cm的茎段，剥去大叶，水冲洗1h左右，酒精快速消毒，无菌条件下5%漂白粉溶液（或其他消毒剂）消毒7-10min，无菌水清洗，解剖镜下剥取茎尖。切取茎尖的大小虽然切取茎尖越小，带有病毒的可能性就越小，但组织培

11、养中，切取的茎尖太小，则不易成活。不同种类的植物和不同病毒，切取的最适茎尖大小也不同。组织培养常用基本培养基是MS培养基或White培养基，它有较高浓度的无机盐，对促进组织分化和愈伤组织生长有利；植物生长调节的种类和配比依培养种类和生长时期来调整。（3） 茎尖培养与热处理相结合脱毒发（4） 微体嫁接法（5） 愈伤组织脱毒法（6） 花药组织脱毒法（7） 化学方法（8） 低温结合茎尖培养法24、 种质资源离体保存：组织培养保存 低温保存 超低温保存 缓慢生长保存25、 植物基因转化受体系统：叶盘受体体系 原生质体受体体系 悬浮细胞和愈伤组织受体体系 配整体受体体系 活体受体体系26、 植物基因转化

12、方法（1） 农杆菌和病毒载体介导的转化方法：根瘤农杆菌和发根农杆菌介导法 病毒载体介导的基因转移（2） 载体直接或无载体基因导入法：基因枪法 PEG介导法 电激法 显微注射法 超声波转化法 碳化硅纤维介导DNA转移法（3） 种质转化法：花粉管通道法 浸泡转化法 27、 转基因植物研究成果（1） 具有抗性和耐性的转基因植物：抗除草剂 抗虫 抗病毒 抗真菌病害 抗细菌病害 抗或耐非生物逆境（2） 品质改良的转基因植物（3） 其他专辑以植物28、 动物细胞培养微环境：温度37度左右、pH6.5-7.8、渗透压、气相环境、细胞培养基质和饲养层细胞、细胞培养的应激。29、 原代培养（1） 概念：指从机体

13、取得材料开始，将培养物放置在培养皿内培养至第一代传代的过程。（2） 方法：组织块法原代培养、酶消化法原代培养、哺乳类禽类和鱼类细胞原代培养。30、 传代培养（1） 概念：细胞长满培养皿细胞生长面后，无论是否稀释，将细胞从一个培养皿转移至另一个培养皿中的培养（2） 方式：贴壁培养、悬浮培养31、 动物细胞基本培养方法：悬滴培养 灌注培养 旋转管培养 克隆培养 培养瓶、培养皿、培养板和盖玻片培养。32、 干细胞概念及分类（1） 概念：是一类具有自我复制能力，并能分化形成一种以上类型细胞的细胞，其来源于胚胎、胎儿或成年个体的具有增殖和分化潜能的细胞。（2） 分类：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞（

14、3） ES细胞系：指能够形成具有种系传递能力的生殖系嵌合体的干细胞。标准：恩能稳定传代，具有大量未分化细胞 用ES细胞检测方法检测具有ES细胞特性和多能性 能反复冷冻解冻而不失去多能性 ES细胞遗传背景明了，来源清楚 无细菌病毒支原体及其他病原体污染。33、 胚胎干细胞的分离培养与建系（1） 胚胎干细胞分离材料的获取和处理：早期胚胎的获取及处理 原始生殖细胞的获取 （2） 胚胎干细胞的分化抑制培养：分化抑制物的选择 基础培养液的选择 添加物的选用（3） 胚胎干细胞系的建立和保存：胚胎干细胞的分离 胚胎干细胞的克隆及常规培养 胚胎干细胞系测冷冻保存34、 体外培养细胞的形态：成纤维细胞型 上皮细

15、胞型 游走细胞型 多形细胞型35、 器官培养概述（1） 概念：指将整个器官、器官的一部分或器官原基放在体外人工环境中，使之存活、生长和保持一定功能的技术。（2） 方法：类似于组织培养中的植块培养方式来培养器官型植块。其基本技术要点，取出动物器官或进一步将其修整成器官型植块，接种到培养基上，在适当的营养、气相以及生长基质条件下，保证其存活和生长。器官培养技术较一般组织培养更复杂。主要目的是在体外环境下维持器官内部的发育分化以及结构与功能特征，以便直观地观察和研究器官的发育分化过程、功能表现及其影响因素。能否达到这一目标是能量器官培养成败的重要指标。（3） 应用：器官的形态发生研究 器官的发育分化

16、研究 胚胎致畸作用研究 器官移植研究 肿瘤侵袭研究36、 动物细胞融合（1） 概念：又称体细胞杂交或细胞杂交，分为种内杂交和种间杂交。 同核体：由同一亲本细胞融合而来； 异核体：由不同亲本细胞融合而来。（2） 方法：病毒诱导法 化学诱导法（PEG法、高pH高Ga2+浓度法、溶血卵磷脂法） 物理诱导法（显微操作法、电融合诱导法、激光诱导法）（3） 过程：细胞凝集 质膜融合 胞质融合 胞核融合37、 单细胞抗体技术（1） 概念：又称杂交瘤技术。通过融合B淋巴细胞和骨髓瘤细胞而同时保持两者的主要特征，形成同时具备抗体分泌和无限繁殖特征的细胞克隆。（2） 过程：亲本细胞准备（致敏B淋巴细胞的准备、骨髓

17、瘤细胞的准备） 细胞融合 杂交瘤细胞的筛选 可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞的单克隆化培养 单克隆抗体的生产和纯化38、 胚胎移植（1） 概念：指对雌性动物进行超数排卵处理，在其发情并配种后一定时间内从其生殖道采集早期胚胎，然后将其移植至未经配种的其他雌性动物生殖道内，通过妊娠孕育后代的技术。（2） 意义：提高优秀母畜繁殖力，加快纯种家畜扩繁速度 加快动物品种改良和育种步伐 提高母畜繁殖效率 与胚胎冷冻技术结合，有利于保存动物遗传资源并代替活畜进行种畜交流 有利于珍稀濒危动物的拯救和保护 可作为胚胎工程等相关研究的重要技术手段。（3） 基本程序：供体受体的选择 供体超数排卵 受体

18、同期发情 供体胚胎回收与质量鉴定 受体胚胎移植。39、 体外受精（1） 概念：指把成熟的卵母细胞或把未成熟的卵母细胞在人工创造的体外培养系统中成熟，与体细胞或体外获能精子在体外条件下完成受精形成受精卵的过程。（2） 意义：基础研究领域 应用研究领域。（3） 过程：卵母细胞的采集 卵母细胞体外成熟培养 精子体外获能 体外受精 显微受精。40、 动物克隆（1） 概念：指通过无性繁殖手段，从一个动物细胞获得遗传背景相同的细胞群或个体群的过程。（2） 意义：可以获得遗传上同质的后代，对动物细胞生物学、遗传学、繁殖生物学和育种学具有重要的理论意义和研究价值，为个体发育中的细胞分化、核质关系及其相互作用机理研究提供了现金的研究手段。在畜牧业生产实际中可以使优良个体大量繁殖；在医学上，为人类治疗性克隆奠定了基础。（3） 细胞核移植基本原理：胚胎细胞、胚胎干细胞、胎儿成纤维细胞以及成体细胞的每一个细胞核都带有可以指导胚胎到个体全程发育的完整遗传物质（即动物细胞的全能性）。（4） 胚胎分割：指对早期卵裂阶段的胚胎，采用卵裂球分离培养法进行同卵双生或同卵多生动物的培育。（5） 细胞核移植过程：核供体细胞的选择和准备 M