类胡萝卜素形成酶基因及其生物代谢工程

1、 类胡萝卜素形成酶基因及其生物代谢工程类胡萝卜素通常是指C40的碳氢化合物（胡萝卜素）和它们的氧化衍生物(叶黄素)两大类色素的总称。它们在结构上由8个类异戊二烯单位浓缩形成，典型的C40类胡萝卜素携带紫罗酮环（ionone），在环的不 同位置可被氧基、羟基、环氧基代替1；类胡萝卜素分子中最重要的部分是决定颜色和生物功能的共轭双鍵系统，能使单态氧失活，猝灭羧基自由基。由于类胡萝卜素本身的化学特性，它们是所有光合生物的基本成分,贮存在生物体的脂相中。在植物中，类胡萝卜素对叶绿体的光合作用起着至关重要的作用，一方面，它们是叶绿体光合天线的辅助色素，帮助叶绿素接收光能；另一方面，它们在高温、强光下能通

2、过叶黄素循环，以非辐射的方式耗散光系统（PS）的过剩能量保护叶绿素免受破坏2,3。除八氢番茄红素、六氢番茄红素等几种类胡萝卜素无色外，绝大多数类胡萝卜素呈黄色、橙色或红色4，是许多植物花和果实呈现鲜艳色彩的原因2。类胡萝卜素也是合成植物激素ABA的前体5。约有10%的类胡萝卜素是维生素A（VA）的前体6,7，人体VA不足易得夜盲症。近年来，越来越多的医学研究表明，类胡萝卜素在猝灭自由基 8、增强人体免疫力9、预防心血管疾病和防癌抗癌2,10等保护人类健康方面起着更为重要的作用。人体血液中主要含有番茄红素、胡萝卜素、叶黄质、隐黄质、胡萝卜素等类胡萝卜素11，但人体不能合成类胡萝卜素，主要依赖饮食

3、中类胡萝卜素的供应。一些重要的类胡萝卜素如玉米黄素，和叶黄质一起，是眼睛斑点色素（macular pigment）中不可缺少的成分,但在食品中含量并不丰富，也不能通过外界药物供给，玉米黄素如长期摄入不足对眼睛健康极为不利12。随着类胡萝卜素药用价值的不断发现，人类对类胡萝卜素的种类和产量需求将越来越大。然而，类胡萝卜素很难通过化学合成，迄今为止，已鉴定的天然类胡萝卜素有600余种，但只有于少数几种类胡萝卜素如胡萝卜素、虾青素、角黄素等能通过化学合成进入商业化生产，它们主要用于营养补充、食品着色和动物饲料的添加；通过天然微生物发酵途径也能生产胡萝卜素、虾青素，但所占的市场份额微不足道13。显然，

4、类胡萝卜素目前这种生产状况已不能满足市场的需求。现代分子生物学研究手段的发展，使得类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程生产类胡萝卜素开辟了道路，近年来，有关这方面的研究在微生物和高等植物上取得重大突破。1. 类胡萝卜素的生物合成途径及其相关酶的基因克隆1.1类胡萝卜素的生物合成途径通过类胡萝卜素生物合成的生化分析、经典遗传学和近年来分子遗传学的研究，已经基本清楚类胡萝卜素的主要生物合成途径。然而对于复杂类胡萝卜素的末端基团、甲基基团及多烯烃链的额外修饰过程仍不太清楚14。所有的类胡萝卜素均通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成。IPP（异戊

5、烯焦磷酸）是该途径的前体物质，IPP在IPP异构酶作用下生成DMAPP（二甲基丙烯基二磷酸），然后再与3个IPP缩合依次生成GPP（牻牛儿焦磷酸）、FPP（法尼基二磷酸）、GGPP（牻牛儿牻牛儿焦磷酸）。2个GGPP在Psy（八氢番茄红素合成酶）作用下形成第一个无色的类胡萝卜素八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续的脱氢反应，共轭双键延长，直至形成链孢红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成胡萝卜素、胡萝卜素，在、胡萝卜素的C4（C4，）引入酮基和（或）C3（C3，）引入羟基以及在环上引入C（5,6）环氧基后,则形成更为复杂的叶黄素（图1）。1.2类胡萝卜素形成酶基因目前，已从细菌、真

6、菌、藻类和植物等生物中分离出150多个类胡萝卜素形成酶基因，它们分别编码20多种类胡萝卜素形成酶17。这些基因的克隆成功为利用DNA重组技术通过微生物生产有经济价值的类胡萝卜素，以及改变植物类胡萝卜素的生物合成途径提高类胡萝卜素的产量提供了便利。 编码早期类胡萝卜素生物合成的酶，如GGPP合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶的基因等占总体的一半以上，其中，八氢番茄红素脱氢酶基因包含两步、三步、四步和五步脱氢反应的不同基因。番茄红素环化酶基因从细菌和植物中克隆到，它能促进双环类胡萝卜素形成；番茄红素环化酶基因仅从植物中克隆到，除莴苣番茄红素环化酶基因外，一般只形成单环。迄今为止，仅有修

7、饰类胡萝卜素环的酶基因得到克隆，包括胡萝卜素羟化酶、胡萝卜素加氧酶（或酮化酶）。在过去几年，已先后从植物上克隆到玉米黄素环氧酶、紫黄质脱环氧酶、辣椒红素/辣椒玉红素合成酶、新黄质合成酶。表1列出了调控类胡萝卜素生物合成的关键酶及其基因。2. 微生物类胡萝卜素基因工程应用DNA重组技术将外源基因导入微生物，利用微生物繁殖快、产量高的特点生产人们需要的、有商业价值的化学物质，是现代生物技术制药工业的主要发展方向20。这一技术的关键是，作为外源基因宿主的微生物首先必须具备大量生产所需要化学物质的前体的能力21。有关类胡萝卜素的基因工程近年来在大肠杆菌和酵母上取得成功。2.1.大肠杆菌大肠杆菌不能形成

8、类胡萝卜素，但它含有的成分如多萜醇、. 苯醌和甲基萘醌类维生素与类胡萝卜素一样，都是由共同前体FPP转化而来22。因此，在理论上讲，向大肠杆菌中转入GGPP合成酶基因crtE后，可诱导体内部分C源转向类胡萝卜素的生物合成。表1编码类胡萝卜素生物合成的酶基因2,17-19酶基因生物登录号类胡萝卜素骨架的构建GGPP合成酶crtE欧文氏菌Erwinia uredevoraD90087crtE集胞藻Synechocystis PCC6803D90899al-3粗糙脉孢霉Neurospora crassaX53979Ggps拟南芥 Arabidopsis thaliana L25813Ggps辣椒 C

9、apsicum annuumP80042八氢番茄红素合成酶crtB农杆菌Agrobacterium aurantiacumD58420crtB集胞藻Synechocystis PCC6803X69172al-2粗糙脉孢霉Neurospora crassaL27652Psy拟南芥 Arabidopsis thalianaL25812Psy黄水仙Lpsea speciosaX78814Psy1番茄 Lycopersicon esculentumA21360Psy2番茄 Lycopersicon esculentumL23424无环类胡萝卜素的生物合成八氢番茄红素脱氢酶Pds拟南芥Arabidops

10、is thaliana L16237Pds玉米Zea maysL39266Pds黄水仙Lpsea speciosaX78815Pds番茄 Lycopersicon esculentumM88683crtP集胞藻Synechocystis PCC6803 X62574crtI荚膜红细菌Rhodobacter capsulatusZ11165crtI欧文氏菌Erwinia uredevoraD90087al-1粗糙脉孢霉Neurospora crassa M57465-胡萝卜素脱氢酶crtQ集胞藻Synechocystis PCC6803 X62574Zds拟南芥Arabidopsis thali

11、anaU38550Zds辣椒Capsicum annuum X68058链孢红素羟化酶crtC球形红杆菌Rhodobacter sphaeroides X82458链孢红素甲氧化脱氢酶crtD荚膜红细菌Rhodobacter capsulatusZ11165链孢红素羟基-氧-转甲基酶crtF球形红杆菌Rhodobacter sphaeroides X82458球形烯 (加)氧酶crtA荚膜红细菌Rhodobacter capsulatus Z11165环化类胡萝卜素生物合成番茄红素环化酶crtY欧文氏菌Erwinia uredevoraD90087crtY集胞藻Synechocystis PC

12、C6803X74599-Lyc拟南芥Arabidopsis thalianaZ29211番茄红素环化酶-Lyc拟南芥Arabidopsis thaliana U50738-胡萝卜素羟化酶crtZ农杆菌Agrobacterium aurantiacum D58420Bch拟南芥Arabidopsis thalianaU58919Bch辣椒Capsicum annuum Y09225玉米黄素转葡糖基酶crtX欧文氏菌Erwinia herbicola M87280-胡萝卜素C(4)加氧酶crtW农杆菌Agrobacterium aurantiacum D58420crtW产碱杆菌Alcaligen

13、es PC1 D58422crtO集胞藻Synechocystis PCC6803 D64004CrtO/Bkt雨生红球藻Haematococcus pluvialisX86782/D45881玉米黄素环氧酶Zep1拟南芥Arabidopsis thaliana T45502Zep1辣椒Capsicum annuumX91491紫黄质脱环氧酶Vde1拟南芥Arabidopsis thalianaN37612紫黄质裂解酶Vp14玉米Zea maysU95953辣椒红素/辣椒玉红素合成酶Ccs辣椒Capsicum annuumX77289-胡萝卜素脱氢酶crtU灰色链霉菌Streptomyces

14、griseusX95596新黄质合成酶Nxs马铃薯Solanum tuberosum AJRose 23等利用大肠杆菌载体pACYC184建立起三个携带欧文氏菌类胡萝卜素形成基因的质粒：pACCRT-EIB（载有 crtE, B, I）、pACCAR16crtX （载有 crtE, B, I, Y, ）和 pAC-CAR25crtX（载有crtE, B, I, Y, Z ）；将它们转入JM101大肠杆菌转化体系后，分别生产出200500 mg/ gDW的番茄红素、-胡萝卜素和玉米黄素 24，25 。Misawa等研究发现，如果将上述质粒的GGPP合成酶基因crtE去除，它们也能生产类胡萝卜素，

15、但产量降为原来的24%26。这一结果表明在大肠杆菌中类胡萝卜素生物合成的最终前体是GGPP，而非IPP，但大肠杆菌GGPP的含量远远低于地FPP，引入编码GGPP合成酶基因crtE增加了FPP向GGPP的转化。将pBluescript II的 lac启动子插入农杆菌类胡萝卜素形成基因crtW 和 crtZ中形成的基因片断，再插进pBluescript II载体构成质粒pAK916 （载有crtW）和 pAK96K（载有crtW 和 crtZ）27,28 ；将这两个质粒分别和pAC-CAR16crtX或 pACCAR25crtX. 一起转入JM101 大肠杆菌菌株，结果类胡萝卜素总量达到4005

16、00g /g DW29。但是，不同组合合成的类胡萝卜素不同，（pAK916和pACCAR16crtX）菌株只产生角黄素，而(pAK96K 和 pACCAR16crtX) 或(pAK916和 pACCAR25crtX)菌株，除积累最终产物虾青素外，还积累了从-胡萝卜素到虾青素的一系列中间产物。这可能是CrtW 和 CrtZ的酶竞争同一底物的缘故27 。 然而，目前商业上生产类胡萝卜素的微生物，如杜氏藻、红球藻，产量已达到50mg/gDW30。虽然上述研究实现了利用大肠杆菌合成类胡萝卜素的目标，但产量仅有10500g /g DW，较之杜氏藻、红球藻等实在太低，因此，有必要在此基础上加以改进。Mis

17、awa等29设想，如果提高大肠杆菌类异戊二烯途径中IPP的产量和IPP到GGPP的转化效率，增加C源向类胡萝卜素生物合成途径的转化量，可进一步提高类胡萝卜素产量。根据这一思路，Wang等通过IPP异构酶和GGPP合成酶在大肠杆菌体内的超量表达，使大肠杆菌的虾青素产量提高50倍31。Albrecht等通过1脱氧木酮糖5磷酸合成酶基因、脱氧木酮糖5磷酸还原异构酶和IPP异构酶在大肠杆菌体内的的超量表达使大肠杆菌中-胡萝卜素和玉米黄素的产量提高3.5倍，最终产量达1.5mg/gDW32。然而如果再增加IPP的合成，则对大肠杆菌菌株产生毒害甚至严重致死，这可能是由于大肠杆菌中用于贮存类胡萝卜素的膜负荷

18、超载。2.酵母目前，用于类胡萝卜素生物合成研究的酵母主要以Saccharomyces cerevisiae 和Candida utilis 两种为材料。2.1酵母Saccharomyces cerevisiae 食用酵母S. cerevisiae 不能合成类胡萝卜素，但体内积累的麦角固醇也是类异戊二烯化合物。麦角固醇与类胡萝卜素的生物合成途径在FPP分叉，这样，通过引入欧文氏菌GGPP合成酶基因crtE竞争FPP，能够将部分FPP从麦角固醇生物合成途径转向类胡萝卜素的生物合成途径。Yamano等 33 将欧文氏菌类胡萝卜素形成基因crtE, crtB, and crtI，用酵母PGK (磷酸甘

19、油酸酯激酶), GAL 7, 和GAP (3磷酸甘油醛脱氢酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 基因的启动子和终止子连接后，插入到酵母载体YEp13上建立一个质粒Y514。该质粒转入S. cerevisiae R7酵母后产生了113 g /gDW的番茄红素，约占10%的麦角固醇转向了类胡萝卜素的合成。将欧文氏菌crtY 基因用ADH 1启动子和 HIP 1终止子连接后插入Y513质粒构建成质粒Y5143，载有Y5143的酵母转化体 S. cerevisiae R7积累了-胡萝卜素33 103 g /gDW，以及少量其它的类胡萝卜素中间产物。Aus

20、ich 等 34 报导，通过欧文氏菌的类胡萝卜素形成基因的遗传操作，在酵母转化体 S. Cerevisiae上获得了番茄红素、-胡萝卜素和玉米黄素。2.2 酵母Candida utilis食用酵母C. Utilis具备大规模生产单细胞蛋白的能力，是生产谷胱甘肽和RNA等几种化学试剂的宿主35，36 (Boze et al., 1992; Ichii et al., 1993)，同时，人们发现，它体内积累的麦角固醇含量是酵母S. Cerevisiae 的23倍37(Miura et al., 1997a)，因此，通过基因工程技术利用酵母C. Utilis生产类胡萝卜素更具有应用前景。利用编码核糖

21、体蛋白的调控基因L41作为抗药标记建立起一个转化体系，38(Kondo et al., 1995)。拥有改良基因L41、欧文氏菌类胡萝卜素形成基因crtE, crtB和 crtI分别用GAP, PGK和 PMA (质膜ATP酶)的启动子和终止子连接构成pCLEBI13-2质粒，再转入C. utilis IFO 0988 (ATCC 9950)，结果产生的758g /gDW DW番茄红素和407g /gDW八氢番茄红素(Miura et al., 1997a).，约有35%的麦角固醇转向了类胡萝卜素的合成。应用46个相应的类胡萝卜素形成基因在合成-胡萝卜素和虾青素方面也取得成功39。(Miura

22、 et al., 1997b).为进一步提高酵母类胡萝卜素产量，使3羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因超量表达调控MVA途径增加萜类化合物前体物质的供应，通过甾醇途径的竞争，破坏编码角鲨烯合成的ERG9基因阻止麦角固醇的生物合成增加不速之客GGPP向类胡萝卜素的合成方向转化，结果获得了能生产7.8mg/gDW的番茄红素的酵母菌株。这一结果标记着微生物类胡萝卜素基因工程已从理论研究向商业化生产迈进40。 3.植物类胡萝卜素生物合成的基因工程. 脊椎动物不能合成类胡萝卜素，他们需要摄入外界的类胡萝卜素才能合成视黄醛（主要的视觉色素）、维生素A、视黄酸（控制形态建成的物质）等维生素。维生素A缺乏是现今发展

23、中国家普遍存在的严重问题，尤其是年老、嗜烟和酗酒的人群。胡萝卜素是维生素的主要前体。据世界卫生组织估测由于维生素A的营养水平不足导致每年至少200万人死亡，其中主要是学龄前儿童41。因此，近年的类胡萝卜素合成的代谢工程主要以提高作物中胡萝卜素的含量为主要研究目标，并以在水稻、油菜、番茄等作物上取得重大突破。3.1水稻42水稻是主要粮食作物，然而，水稻胚乳虽然能够合成并积累GGPP，但却不能形成类胡萝卜素。如果通过基因工程技术使其生产胡萝卜素，则可望减轻在亚洲、非洲、南美洲等地区VA缺乏的状况。根据类胡萝卜素的生物合成途径，若要将GGPP转化成胡萝卜素，在水稻中必须完成四步不同的生化反应，为此必

24、须将PSY、PDS、ZDS、LCY基因一起转入水稻植株。由于细菌八氢胡萝卜素脱氢酶（crtI）能够完成两个植物脱氢酶PDS、ZDS的共同作用，故可将基因减为PSY、crtI、LCY三个成员。研究人员将分别将黄水仙的PSY、LCY基因连接到胚乳特异表达的谷蛋白启动子上，细菌八氢番茄红素降解酶基因crtI连接到花椰菜斑点病毒35S启动子上，然后一起构成表达载体转入到一个日本水稻品种。结果获得了胚乳呈黄色的“金大米”，种子中含有胡萝卜素，此外，还意外含有大量的玉米黄素、叶黄质。这一结果表明胡萝卜素羟化酶基因（BCH）可能和LCY一起在正常水稻胚中组成型表达，或者受番茄红素形成的诱导表达。转基因水稻胚

25、乳中胡萝卜素的含量最高达1.6g/g,，每天食用300g这种“金大米”能提供人类1020%的胡萝卜素。如今，金大米已经被捐赠给设在菲律宾的国际水稻研究所，用于开发富含胡萝卜素的水稻新品种。3.2油菜43八氢番茄红素合成酶的遗传操作在油菜作物上获得巨大成功。将欧氏杆菌八氢番茄红素合成酶基因crtB与油菜napin基因启动子构建成种子特异表达载体转入到油菜。结果转基因油菜胚呈橙色，而对照呈绿色；种子中类胡萝卜素含量增加50倍，达到1600g/gFW.，其主要类胡萝卜素成分为胡萝卜素和胡萝卜素。这种金色菜油在抗拒VA的缺乏方面具有重要的应用前景，如今已被孟山多（Mnsanto）公司和设在印度的Tat

26、a能源研究所合作开发。3.3番茄八氢番茄红素是类胡萝卜素的生物合成途径中的第一步，故成为番茄基因操作中优先考虑的目标。Bramley等44将番茄Psy基因反义导入番茄, GGPP积累,类胡萝卜素含量大大下降, 表明Psy基因在番茄类胡萝卜素生物合成中起限速作用。Fray和Grierson45等将番茄PYS基因正义导入番茄黄果突变体，果实成熟时重新积累番茄红素；接着， Fray等46将番茄Psy基因正义导入番茄，结果Psy的cDNA在转基因番茄中的组成型表达导致了离区和幼果类胡萝卜素异常生成，植株矮化，这是由于将进入GA途径的GGPP转向了类胡萝卜素的生物合成。这种植物的果实形成番茄红素的时间提

27、早，但番茄红素的含量却比野生型低。Fray和Bramley的最新研究（未公开发表）显示，将欧氏杆菌（Erwinia）八氢番茄红素合成酶基因（crtB）以果实特异表达的方式转入番茄，获得了果实类胡萝卜素总量增加两倍的转基因植株。为提高番茄果实的胡萝卜素，Rosati等将从番茄自身克隆到的番茄红素环化酶基因正义导入番茄植株，结果果实中胡萝卜素含量增加3.8倍，但类胡萝卜素总量基本不变47。番茄红素是人体血液中的主要类胡萝卜素，它在抗氧化和防癌的功能日益受到人们的关注。故许多研究人员试图基因工程的方法提高番茄红素含量。研究人员试图让类胡萝卜素生物合成途径中的早期酶（PYS、PDS）过度表达，Rmer

28、 和 Fraser等将细菌八氢番茄红素脱氢酶基因（crtI）和花椰菜斑点病毒35S启动子构成组成型表达载体转入番茄，结果令人失望，不仅番茄红素的含量没有增加，而且类胡萝卜素的总量减半48。但好的是胡萝卜素含量提高到原来的3倍，占总量的50%，约5mg/100g，从而使得这些番茄呈橙色。在crtI番茄的叶子中，环类胡萝卜素种类稍微增加，但环化途径的类胡萝卜素减少，可能是因为35S启动子组成型表达的结果。他们推测尽管叶黄质是叶片中环化途径的主要类胡萝卜素，但在光合作用中并非必不可少，目前仍不清楚这些变化对光合作用的表现是否有细微的影响。研究者将crtI转入番茄后LYC的mRNA水平增加1.7倍41

29、，这些结果足以解释胡萝卜素的增加不是偶然的。3.4烟草Misawa等49将细菌八氢番茄红素基因正义导入烟草，b-胡萝卜素合成增强,同时对除草剂norflurazon抗性增强。Kumagai等50将辣椒红/辣椒玉红素合成酶基因正义导入野生烟草, 植株呈橙色，叶片中积累辣椒红素，含量占类胡萝卜素总量的36%。 虾青素是鲑鱼、虾等水生鱼类肉色呈现粉红色的重要色素。在自然界，虾青素不能由植物合成，只能由水生细菌和微藻类合成，经过鱼进入食物链。然而，水生养殖的鱼类与自然界的食物链分隔，因此必须在饲料中添加虾青素才能使鱼肉呈现粉红色的特征。从海藻Haematoco-ccus中克隆出来的编码-C-4-氧化酶

30、基因crtO，在酮类类胡萝卜素生物合成中起关键作用51。将该基因与番茄Pds基因启动子结合转入烟草后，植株叶片中类胡萝卜素成分及含量没有改变，表明由Pds启动子调控的组织特异表达的酮化酶可能在叶绿体中不表达；但在花的蜜腺有色体中积累高浓度的酮类类胡萝卜素，类胡萝卜素总量增加40%。其中主要成分为虾青素，使花的颜色从黄变红。结构分析表明，转基因烟草形成的虾青素与水生生物形成的天然虾青素具有相同的空间螺旋特性（3S3，S）52， 这一结果表明，通过基因操作利用植物生产特定的有商品价值的类胡萝卜素也是切实可行的。基因操纵类胡萝卜素生物合成途径已经在微生物和作物上成功地用来增加和调整类胡萝卜素的积累。

31、在微生物中，通过基因工程已能将类胡萝卜素合成向设定的方向发展，同时能克服用于合成类胡萝卜素的前体物质，如IPP、GGPP等萜类化合物供应的瓶颈。但是，达到高产的主要问题是寄主对类胡萝卜素的贮存能力。摆在人们面前的是如何在细菌和真菌中建立一个类胡萝卜素区室化的系统。若是这一问题被解决，则通过异源寄主发酵生产类胡萝卜素将会进入商品成功。在作物上操纵类胡萝卜素生物合成以增加类胡萝卜素含量时，人们仍未注意到这将干扰其它的萜类化合物的合成途径，但是利用器官特异性启动子将其定位于原来代谢水平低的果实和种子的组织中可以避免这一问题。可能有更多的类胡萝卜素生物合成与其它萜类化合物的合成途径的联系尚未清楚，但类

32、胡萝卜素的代谢工程将会揭示这一点。通过引入转基因精确调控类胡萝卜素的生物代谢的主要障碍是我们对内源类胡萝卜素合成基因在高等植物中如何调控表达知之有限，我们仍然在试图理解在外源基因引入后内源类胡萝卜素合成基因为何并如何表达。一些研究者将提高食用植物中胡萝卜素含量来解决VA缺乏的问题作为动力，将转基因植物与其它本身含有胡萝卜素的植物叶片和胡萝卜根（6mg/gDW carotenoid,3 mg/gDW - carotenoid）相比，其生产类胡萝卜素的含量是低的，上述的转基因番茄中获得的高胡萝卜素含量也低于传统育种选育的高胡萝卜素含量的品种。然而在油菜上获得高产胡萝卜素植物油的巨大成功是调控类胡萝

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