蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

1、蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用荧光素FITC标记抗体纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合1520个，一个IgG分子可结合28个分子的FITC，其反应式如下:FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 FITC-NS-C-N-H2-蛋白质FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得

2、到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记步骤：(1)试剂和材料 001molL(pH72)PBS配法中，校定pH至72。NaCI18g、Na2HP04 115g，溶于2000ml蒸馏水01molL(pH90)碳酸盐缓冲液配法 取05molLNa2CO3(53)10ml加入05molLNaHC03(42)90ml，混合后，校定pH至90。3碳酸钠水溶液配法 称5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。其他试剂和材料 l叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。(2)方

3、法及步骤 取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(015molLNaCl)及缓冲液(05molLNaHC03Na2C03，pH90)稀释使每毫升内含蛋白质1-5mg，缓冲液为总量的10，降温至4。加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素蛋白：荧光素(5080)mglmg，在04下电磁搅拌1214h。然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮化钠0.01，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4)可以用半年以上，-20保存可达2年以上。4透析标记法

4、此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。(1)试剂和材料 试剂和材料同改良法。(2)方法及步骤 用0025molL碳酸盐缓冲液pH90，将欲标记免疫球蛋白稀释成1浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将FITC配成01mgml的溶液，按10mgml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4中。 FITCCAS#：3326-32-7中文名：异硫氰酸荧光素英文名：Flourescein iso

5、-thiocyanate；FITC结构式：分子式：C21H11NO5S分子量：389.38性质：1. 外观：黄色粉末2. 纯度：95% (HPLC)3. 产品描述： FITC能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。最大吸收光波长为490495nm，（黄绿光范围）最大发射光波长为525530nm.（黄光范围） 4. FITC标记抗体流程：（1）将待交联的蛋白（浓度2mg/mL）对交联反应液透析三次4 ，至pH9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3

6、，1.06g Na2CO3，7.36gNaCl，加水定容至1L。（2）将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。（3）按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:50g 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 反应8 h。（4）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L（稀释100倍），4终止反应2 h。（5）将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。（6）交联物的鉴定蛋白浓度(mg/mL) = A280 0.31A495 / 1.4F/P比例: 3.1A495 / A280 0.31A495 ，该值

7、应介于2.5 6.5之间。 （7） FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4避光保存。储存条件：4避光保存实验要点及说明：偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此pH水平； FITC与蛋白质的比值（F/P）,可通过测定495nm与280nm吸光度来鉴定。此比值的范围应为0.31.0； FITC唯一的缺限是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存； 如果FITC复合物对PBS透析不充分，可能造成高本底，对免疫荧光染色产生干扰。1. Prepare a solution of at least 2 mg/ml

8、of protein in 0.1 M sodium carbonate buffer, pH 9.Notes: Do not store sodium carbonate-bicarbonate buffer more than 1 week at 0-5 C. The pH of the buffer may change upon storage. It is advised that fresh buffer be made just before use.The protein to be conjugated should be free of contaminating prot

9、eins, and protein solutionsshould not be prepared in buffers containing sodium azide or amines such as Tris or glycinesince they inhibit the labeling reaction. If the buffer contains amines or sodium azide, dialyze protein solution against PBS, pH 7.4, overnight at 0 - 5 C. Avoid dialysis at high pH

10、 values ( 8.0-8.5) as this may be harmful to some proteins. 要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应，因此会降低蛋白质与FITC的偶联率）2. Dissolve the FITC in anhydrous DMSO at 1 mg/ml.将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。Note: This should be prepared fresh for each labeling reaction.3. For each 1 ml of protei

11、n solution, add 50l of FITC solution, very slowly in 5 ml aliquots while gently and continuously stirring the protein solution.按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:50g 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 反应8 h。4. After all the required amount of FITC solution has been added, incubate the reaction in the dark for

12、8 hours at 4 C.5. Add NH4Cl to a final concentration of 50 mM and incubate for 2 hours at 4 C.加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L， 4 终止反应2 h。6. Add xylene cyanol to 0.1% and glycerol to 5%.7. Separate the unbound FITC from the conjugate by gel filtration using a fine-sized gel matrix with an exclusion limit

13、of 20,000 to 50,000 (for globular proteins such as antibodies). With the column flow stopped, carefully layer the reaction mixture onto the top of the column. Then open the column, allowing the reaction mixture to flow into the column. Just as it all enters the column bed, carefully add PBS to the t

14、op of the column and connect to a buffer supply. Two bands will form on the column. The faster moving band, which is the conjugated protein, elutes first and can usually be seen under room light. The slower moving band is the unreacted (free) FITC and xylene cyanol and will elute only with subsequen

15、t PBS washes.8. Store the conjugate at 4 C in the column buffer in a light-proof container. Sodium azide may be added as a preservative (final concentration 15 mM). If the protein concentration is low ( 1 mg/ml), bovine serum albumin (BSA) may be added to a final concentration of 1%.9. The ratio of

16、fluorescein to protein of the product can be estimated by measuring the absorbance at 495 nm and 280 nm. The F/P ratio should be between 0.3 and 1.0. Lower ratios will yield low signals; higher ratios will give high background.葡聚糖凝胶柱的使用方法(1) 预处理称取Sephadex G-25（50100目）约5（1）g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h(过夜)进行溶胀

17、。（将溶胀时漂在表面的颗粒去掉）(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须倒出重装，装好后，用蒸馏水平衡23h即可加样品分离。(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后

18、，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器23次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.81.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗

19、涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60烘箱中烘干，回收保存。实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。2学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3氯1，2环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖

20、和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子

21、量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。 本实验以葡聚糖凝胶G25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖2000分子量接近2106， 而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。【实验材料】1.实验器材层析柱(120cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂 (1) Tris醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至

22、7.0，加蒸馏水至1000m1。 (2) 溴酚蓝溶液：称取溴酚蓝10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分搅拌使其溶解，然后逐滴加入Tris醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。 (3) 蓝色葡聚糖2000溶液：称取蓝色葡聚糖2000 10毫克，溶于2毫升Tris醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。 (4) 样品溶液：取溴酚蓝溶液0.1毫升，蓝色葡聚糖2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。 (5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)【实验操作】1.实验凝胶的制备：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶

23、胀 2小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(pH7.0的Tris醋酸溶液)洗涤23次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。室温溶胀法取SephadexG250凝胶10g,置于烧杯中, 加入新鲜的超纯水300ml, 用玻璃搅棒轻轻搅匀, 用封口膜密封, 室温放置过夜, 使其充分溶胀, 第2天进行倾斜浮选, 除去漂浮于水面的细小颗粒, 备用。处理过程中应避免剧烈搅拌,以防止破坏凝胶结构。此法较温和, 不易造成凝胶结构的改变, 推荐使用。 2.装柱：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作

24、为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，最后保留约2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。3.加样品：打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。取溴酚蓝及蓝色葡聚糖2000混合液0.3毫升，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层

25、析柱床表面。打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。最后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为34cm。 4.洗脱与收集：连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升即换一支收集管(试管预先编号)，收集约20管左右，样品即可完全被洗脱下来。将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。 5.凝胶回收处理方法：将样品完全洗脱下来后，继续用三倍

26、柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。6. 将流洗过的葡聚糖凝胶放入烧杯或广口容器中, 加入叠氮钠, 终浓度为0. 02% ,封好口, 置于4 冷藏箱内保存可达数月。2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小

27、的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。正相系统以氯仿甲醇最为常见，先用50氯仿甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇水），样品用最少体积的甲醇水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex L

28、H20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿甲醇），样品用最少体积的氯仿甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 5 Sephadex LH-20的步骤。(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。(2) 饱和层析柱：用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确

29、比例的洗脱剂中。(3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。(4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。(5) 洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。再生以备下次使用。6 分离的技巧，最后说说我的使用心得（1） 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。（3） 馏分一定要接的细，可110，或120 个保留体积接成一馏分。（4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20