第10章_高效液相色谱分离检测技术

1、4.4,高效液相色谱分离方式,液谱分离系统,液固吸附色谱,HPLC,分离方式,分配色谱,离子交换和离子色谱,离子对色谱,体积排阻色谱法,亲合色谱法,4.4.1,液谱分离系统,1,、固定相（柱填料）,常用填料基质可分为硅胶、氧化物和聚合物。,硅胶是,HPLC,填料中最常用的基质。它具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好的,化学稳定性和热稳定性以及专一,的表面化学反应等优点外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰富的,硅羟基，这是硅胶可以进行表面键合或改性的基础。,缺点：在碱性水溶性流动相中不稳定。,目前市场主要可供选择的硅胶填料粒径,?,1.7m,，,1.8m,，,2.2m,快速液相

2、色谱柱：匹配快速色谱仪,?,2.7m,多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离,(Halo),?,3.0m,，,3.5m,普通快速分析,?,5.0m,常规分析,颗粒越小，柱效越高，但是耐污染性能下降，柱压升高。,1.,液,-,液分配及离子对分离固定相,（,1,）全多孔型担体,氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用,100,m,的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。,现采用,10,m,以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。,（,2,）表面多孔型担体,（薄壳型微珠担体）,30,40,m,的玻璃微球，表面附着,一层厚度为,1,2,m,的多孔硅胶。,表面积小，柱容量底。,4.4.1,液谱分

3、离系统,液,-,固色谱法（,LSC,）,固定相状态分,液,-,液色谱法（,LLC,）,吸附色谱法,HPLC,分配色谱法,离子交换色谱法,分离机制分,分子排阻色谱法,化学键合相色谱法,亲合色谱法,离子色谱法,一、化学键合相色谱法,化学键合相（,chemically bonded phase,）,将固定液（含不,同官能团的有机分子）利用化学反应键合到,载体,表面上，使,其形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相,载体,-,硅胶,键合反应,-,硅烷化反应、硅酸酯化反应,1,键合相类型,类型,非极性固定相,(,ODS,）,R,1,Si,R,2,Si,OH,+,Cl,C,18,H,37,-HCl,Si,

4、O,R,1,Si,R,2,C,18,H,37,极性键合相,（,键合,-NH,2,、,-CN,、醇基等极性基团）,离子型键合相,（,键合可交换阴或阳离子基团,),2,分离原理,特征,-,固定相极性流动相极性,流动相,-,有机溶剂,（,1,）正相键合相色谱法,分离机制,-,类似液,-,液分配色谱的分离原理,应用范围,-,适于分离溶于有机溶剂的,极性至中等极性的分子型化合物,(,如脂,溶性维生素、脂、芳香醇、芳香胺等）,（,2,）反相键合相色谱法,特征,-,固定相极性流动相极性,流动相,-,水,+,有机调节剂,分离机制,-,“,疏溶剂作用,”,理论,应用范围,-,适用于分离非极性至,中等极性的分子型

5、化合物,疏溶剂作用理论,利用非极性溶质分子或,溶质分子中非极性基团和极,性溶剂接触时产生排斥力，,而从溶剂中被“挤出”，即,产生疏溶剂作用，促使溶质,分子与键合相表面的非极性,的烷基发生疏水缔合，而使,溶质分子保留在固定相中,.,想一想,影响溶质保留（时间长短）的因素有哪些,?,影响溶质保留（时间长短）的四大主要因素,（,1,）溶质分子中非极性部分的总表面积,溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈,弱，疏水性越强，保留值越大。,（,2,）键合相上的烷基总面积,烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长，,烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基,碳链长度

6、的增加而增大,。,固定相：,C,1,固定相：,C,8,固定相：,C,18,时间，,min,1-,尿嘧啶；,2-,苯酚；,3-,乙酰苯；,4-,硝基苯；,5-,苯甲酸甲酯；,6-,甲苯,（,3,）流动相的表面张力,流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；,溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱，,导致溶质的保留值大。,（,4,）,流动相的酸碱性和盐浓度,酸性抑制弱酸解离，增加保留时间；碱性抑制弱碱解离，增,加保留时间；盐浓度增加,不利于,离子化溶质保留。,二、离子色谱法,1.,离子色谱法,（,IC,）,离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法,2,分离原理,抑制型（双

7、柱型,),分离柱,交换反应：,R,+,-OH,-,+ NaX R,+,-X,-,+ NaOH,洗脱反应：,R,+,-X,-,+ NaOH R,+,-OH,-,+ NaX,抑制柱,与组分反应：,R,H,+,+ NaX R,-Na,+,+ HX,与洗脱剂反应：,R-H,+,+ NaOH R,-Na+ + H,2,O,在无抑制柱的离子交换色谱中，进入检测器的是高电导的洗脱剂,NaOH,及被洗脱的组分,NaX,，后者所产生的电导的微小变化被洗脱剂的高,本底所淹没，难于检测。而加了抑制柱后，进入检测器的本底是电导率,很低的水，因此很容易检测出具有较大电导率的,HX,。,2,固定相与流动相,基质,-,合成

8、树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶,（,1,）固定相,类型,离子交换剂,-,键合的离子交换基团,符号,官能团,强阳离子交换剂,弱阳离子交换剂,SCX,WCX,SO,3,H,COOH,强阴离子交换剂,弱阴离子交换剂,SAX,WAX,N,+,R,3,NH,2,（,2,）流动相,-,水缓冲溶液,选择规则,使其在固定相上的保留时间减少，先出色谱柱,;,反之，则保留,时间增大，后出色谱柱,.,（,2,）,pH,增大，酸的离解度增大而值增大，保留时间增加，后,(1),增加流动相中盐的浓度，可以降低待测离子的竞争亲和力，,出柱；但有机碱的离解度降低而分配比减小，保留时间减小，,先出柱。,(3),缓冲溶液中缓冲剂

9、浓度增大,;,保留时间会减小。,三、反相离子对色谱法,1,分离机制,在反相色谱法中，将一种或多种与被测离子电荷相反的离子（称为对离,子或反离子）加到极性流动相中，使其与被测离子结合，形成疏水性（中性,或弱极性）的离子对缔合物,而被非极性固定相（有机相）萃取，进入固定相,被保留,.,因待测组分离子的性质不同、反离子形成离子对的能力不同和形成离,子对疏水性的不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间的不同，因而出色,谱柱先后不同，实现分离,.,生成离子对反应,-,A,(,水,相,）,+,+ B,(,水,相,）,-,+,A,B,(,有,机,相,）,被测离子,反离子,烷基磺酸或盐类,(,十二烷基磺酸钠,）

10、,阳离子,2,常用,离子对,试剂,分析有机碱类和有机阳离子,季铵盐类,(,四丁基季铵盐、十六烷基三甲基季铵盐,),阴离子,分析有机酸和有机阴离子,3,固定相与流动相,(1,）固定相,-,ODS,等非极性固定相,(2,）流动相,-,甲醇,-,水或乙腈,-,水体系中加入适量离子对试,剂，并用缓冲液调至合适的,pH,。,分离有机碱的,pH,值一般为,33.5,；分离有机酸的,pH,值一般在,7.5,左右。,第,2,节,高效液相色谱仪,高效液相色谱仪结构及流程,一、输液系统,恒压泵,(,淘汰,),1,高压输液泵,恒流泵,单柱塞往复泵,双柱塞往复泵,(,串或并联,）,单柱塞往复泵结构示意图,内梯度,-,

11、高压泵将溶剂按程序压入混合室，,2,梯度洗脱装置,混合后再注入色谱柱,外梯度,-,多元溶剂通过比例阀再由泵注入色谱柱,二,元,内,梯,度,洗,脱,装,置,示,意,图,四元,外梯度洗脱,装置双泵,(,串联,),工作原理示意图,等度洗脱,3,洗脱方式,梯度洗脱,想一想,分别在何种情况下选择等度或梯度洗脱,?,二、进样系统,1,六通阀进样器,2,自动进样器,三、分离系统,分,析,型,柱,常量柱内径,2,4.6mm,，柱长,10,25cm,半微量柱：内径,1,1.5mm,，柱长,10,20cm,毛细管柱：内径,0.5,1mm,，柱长,30,75mm,1,色谱柱类型,制备型柱,内径,20,40mm,，柱

12、长,10,30cm,分析型,制备型,2,填充剂,-,最,常用填充剂为化学键合硅胶,四、检测系统,1.,紫外检测器,可变波长检测器,光电二极管阵列检测器,光电二极管阵列检测器结构与光路示意图,三维色谱图,介电型,-,测量两电极之间电容介质的介电,常数变化测得组分浓度,2,电化学检测器,电导型,-,测电导率变化来测量电离物质含量,电位型,-,测定电流为零时电极间的电位差值,安培型,-,测定电极间的电流变化而测定样,品浓度,典型电化学检测器示意图,3,蒸发光散射检测,蒸发光散射检测器工作原理示意图,五、数据记录及处理系统（,类似于,GC),ELSD,是基于,光线通过微小,粒子时会产生,光散射的现象,

13、第,3,节,定性与定量分析技术,一、定性分析技术,1,色谱鉴定法,2,两谱联用鉴定法,LC-UV,LC-MS,二、定量测定分析,(,外标法、内标法）,1.,加校正因子的主成分自身对照法,(1),校正因子测定与计算,A,杂,/,c,杂,f,?,A,主,/,c,主,(2,）测定,测定杂质含量时，按供试品质量标准项下规定的杂质,限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对,照液，进样，调节检测灵敏度（以噪音水平可接受为限）,或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色,谱峰的峰高约达满量程的,10%,25%,或其峰面积能准确积,分。取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样。除有特,殊规定外

14、，供试品溶液的记录时间应记录到主成分色谱峰,保留时间的,2,倍，测量供试品溶液色谱衅上各杂质的峰面,积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面,积比较，依法计算各杂质含量。,2,不加校正因子的主成分自身对照法,按上述（,1,）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，,取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样。除供试品质量,标准项下有特别规定外，供试品溶液色谱图记录的时间应,为主成分色谱峰保留时间的,2,倍，测量供试品溶液色谱图中,各杂质的峰面积并与对照溶液的主成分的峰面积比较，计,算杂质的含量。,第,4,节,高效毛细管电泳简介,一、毛细管电泳分离原理简介,1.,电泳流,(,电泳,) -,在电解质

15、溶液中，带电粒子在电场作用,下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移,2.,电渗流,（,电渗,),-,在一般性况下（,pH,3,）石英毛,细管柱内表面带负电，和溶液接触时形成双电层,;,在高,压电场作用下，双电层中的水合阳离子整体朝负极方,向移动,电渗流的速度,=,57,倍电泳流速度,阳离子迁移速度,电渗速度,电泳速度,3.,粒子迁移速度,阴离子迁移速度,电渗速度,电泳速度,中性粒子迁移速度,电渗速度,4.,分离原理,在一定电场作用下,在毛细管中的各种不同的粒子,电泳速度和电渗速度也各不相同，电渗流可以带动阳离,子、阴离子和中性物质以不同的速度从阴极端流出而实,现分离。,二、毛细管电泳仪的基本装

16、置,毛细管柱、柱恒温,系统、电解液槽、,进样器、高压电源、,检测器和数据处理,器,毛细管电泳装置示意图,1,毛细管柱及温度控制,空心柱,-,区带电泳、胶束电泳及环糊精电泳,（,1,）毛细管柱,填充毛细管柱,-,电色谱,壁处理柱,-,蛋白质电泳,作用,-,消除电泳产生的焦耳热,（,2,）毛细管恒温装置,精度,-,0.1,恒温方式,高速气流恒温,液体恒温,电压,:030kV,直流电源,2,高压电源,稳定性,:,0.1%,电流强度,:200300mA,电源极性切换装置,(,双极性电源,),进样端加压进样,流体进样,出口端真空进样,3,毛细管电泳进样方法,高差进样,电动进样,（瞬间高压脉冲进样,),4

17、,电极和溶液控制系统,(1,）电极,-,置于两侧的电泳池中铂丝电极,自动进样器,(2,）溶液控制系统,分部收集器,更换缓冲液装置,缓冲液的水平系统,紫外,-,可见光检测器,二极管阵列检测器,荧光检测器,质谱检测器,电化学检测器,激光类检测器,5,检测器,三、毛细管电泳法的模式及应用,名称,毛细管区带电泳,胶束电动毛细管电,泳,毛细管凝胶电泳,毛细管等电聚焦,缩写,CZE,MEC,C,CGE,CIEF,管内填充物,pH,缓冲的自由电,解质溶液（可,含添加剂）,CZE,载体,+,带电胶,束,电泳用凝胶或其它,筛分介质,pH,梯度两性电解,质,分离分析对象,无机离子、有机物、对映体拆,分、各种生物分子,小分子、中性分子、对映体拆,分,蛋白质、核酸、聚合酶链反应,产物、寡聚核苷酸,等电点差异小的蛋白质、氨基,酸,毛细管等速电泳,CITP,区带前后使用两种,不同缓冲液,CZ