AFLP实验操作指南(修改后

1、 AFLP实验操作指南一、 实验操作流程1 提取DNA样本2 DNA酶切、连接同时进行（1） 反应体系（50ul）成 分体 积（ul）双蒸水35.810*Tango buffer5EcoRI(10u/ul)0.5Mse(10u/ul)0.5Ea （5pmol/ul）1Ma （50pmol/ul）110mM ATP1T4DNA连接酶（5U/ul）0.2模板DNA（100ng/ul）5总体积50（2） 反映程序37反应35个小时，最后保存于4。（3） 检测 取46ul酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好。（4） 稀释按1：10的比例稀释，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于-20

2、oC备用。 3 预扩增（1） 反应体系成 分体 积（ul）双蒸水4.4Premix taq10EA00(100ng/ul)0.3MC00(100ng/ul)0.3稀释后已连接DNA模板5总体积20（2） 反映程序 a、94 2min b、94 30s、56 30s、72 1min共24个循环 c、72 5min d、保存于4（3） 检测取未稀释的预扩增液46ul进行琼脂糖电泳检测。 （4） 稀释 取部分预扩增后溶液按1：25的比例稀释。将已稀释的和未稀释的保存于20储存。 4.选择扩增（4） 反应体系成 分体 积（ul）双蒸水4Premix taq10EA-(100ng/ul) *0.5MC-

3、(100ng/ul) *0.5稀释后已连接DNA模板5总体积20*:EA-,MC后面两个碱基因不同引物对而不同。迅速漩涡混匀10s，或者离心4000r/min，10s。（2） 反应程序a、94 4minb、第113个循环：94 30s, 65 30s, 72 1min（退火温度每隔一个循环降低0.7）；c、第1436个循环：94 30s, 56 30s, 72 1min；d、72 5min, 4保存。6变性（1） 变性剂（Loading buffer）配方组 分体 积98%去离子甲酰胺49mlEDTA(0.5M PH=8.0)1ml二甲苯青FF(Xylene Cyanole FF)0.125g

4、溴酚蓝（Bromphenol Blue）0.125g（2）变性：将7ul 变性剂加入14ulPCR反应产物，95变性5min，并迅速置于冰上。7. 制胶溶液（1） 一块胶的配方（60ml）将12ml 5XTBE和25.2g尿素（Urea）混合加水定容至51ml，向其中加入9ml 40的丙烯酰胺溶液，240ul 10%过硫酸胺（APS）和60ul四甲基乙二胺（TEMED）。（2） 各组分配方5X TBE：54g Tris碱( Tris-base）,27.5g硼酸( B-acid）和3.72gEDTA(或0.5M,PH=8.0，EDTA 20ml)混合定容至1L。40丙烯酰胺溶液：2g甲叉双丙烯酰

5、胺（N、N-Methylene Bisacrylamide）,38g丙烯酰胺（Acrylamide）混合加水定容至100ml，4棕色瓶可保存2个月。10过硫酸胺溶液：1g过硫酸胺（APS）加ddH2O定容至10ml。8. 亲水和疏水处理及灌胶（1） 长玻璃（亲水玻璃）处理：a、亲水剂制备：3ml无水乙醇，10ul亲水硅烷,10ul冰醋酸混合。此为一块板用量。b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。c、用手巾纸浸亲水剂涂搽玻璃板。d、干燥20分钟，用约2ml 95的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向再涂搽一遍。 e、晾干约十分钟。（2） 短玻璃（疏水玻璃）处理 a、换手套，以防亲水

6、剂和疏水剂交叉污染。如果出现污染情况，可将玻璃浸入10的NaOH溶液中。 b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。 c、用纸巾浸750ul剥离硅胶分两次涂搽玻璃板，要均匀。 d、干燥20分钟，用约2ml 95的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向再涂搽一遍。 e、晾干约十分钟。 f、疏水处理做一次大约可以跑5块胶再做或当出现轻微扯胶情况时再做。（3） 将长玻璃放在水平泡沫垫上，亲水面向上，将两个胶条平行分置于其较长的两边，然后轻轻放上疏水玻璃，疏水面向下。这样在两玻璃间形成了一个矩形空隙。用夹子夹住固定。（4） 用胶带将左右两边和底边封上，留出插梳子的边（有凹边的那一边），封时要均

7、匀不留气泡。（5） 将梳子插入有凹边的缝隙，看是否容易均匀，不行要适当调整。（6） 将有凹边的那边稍稍垫高，然后配胶用注射器筒灌入，要从一边均匀灌入，胶中不留气泡。（7） 将梳子平直边插入凹口缝隙，以形成一个胶的平直端。注意其端线应与玻璃板的长边垂直。（8） 让胶至少聚合两个小时。 9. 电泳（1） 将电泳槽底盒装入400ml 1X TBE 缓冲液，上盒装入500ml 1X TBE缓冲液。（2） 轻轻拔掉梳子，固定玻璃于电泳仪上，到入上盒缓冲液，用1000ul枪冲洗凹口缝隙，冲干净为好，65W预电泳30min。（3） 预电泳完毕断开电源，再次冲洗缝隙，然后将梳子齿端插入凹口缝隙，其齿尖端轻轻的

8、插进胶中，以构成点样孔。（4） 点入35ul变性后的样品。（5） 65W电泳约90min，直到溴酚蓝到离顶端1/2为好。（或二甲苯青刚到底部）（6） 电泳完毕，分开两玻璃板，将固着胶的亲水板放入预先准备好的10的醋酸固定液中浸泡固定脱色。 10. 银染（1） 试剂的配制1. 固定/终止溶液（10%的冰醋酸）：将200ml冰醋酸加入到1800mlddH2O中，现用现配，不能反复使用。20min2. 染色液：2L超纯水中加入2g硝酸银。3. 反应液：2L超纯水中加入30gNaOH、10ml甲醛，冰浴中冷却至10。（2） 染色步骤1. 将长、短玻璃板分开：电泳结束后，用一个塑料棒小心地将长短板分开，

9、聚丙烯酰胺应粘附在短玻璃板上。2. 固定胶：将粘着聚丙烯酰胺凝胶的短玻璃板放入塑料浅盘中，加入固定终止液，使粘着胶的玻璃板浸泡在固定/终止液中。将胶在摇床上摇动20min或至电泳示踪染料消失。胶可在固定/终止液中过夜，收集固定终止液，以备下面步骤8中终止染色反应用。若此时反应液尚未冷却，可放入冰浴中致冷。3. 洗胶：在摇床上用超纯水洗胶3次，每次2min，或3min，2次。每次洗完后将粘着胶的玻璃板取出沥干1020s再进行下一次洗涤。4. 染色：将粘着胶的玻璃板移至染色液中，在摇床上摇动30min。将胶从染色液中取出，放在一边。染色液回放到烧杯中，塑料盘清洗后加入超纯水。这段时间不要超过510

10、s。漂洗时间过长会导致信号变弱。5. 洗胶：将胶浸入超纯水中，取出沥水，立即放入盛有预冷反应液的塑料盘中。胶从超纯水中取出到放入反应液的时间不能超过510s。6. 显色反应：胶在摇床上摇动至出现模板带或可见一条带。将胶转至剩余的1L预冷的反应液中，继续显色10min或更久直至全部条带显现出来。7. 终止显色反应：往反应液中加入1L固定/终止液，在摇床上反应23min，终止显色反应。时间过长会使条带褪色。8. 洗胶：用超纯水漂洗聚丙烯酰胺凝胶2次，每次2min。9.干胶、观察：通过热对流或室温放置，使胶变干。在白光灯下，也可置于白色或黄色背景下观察，用单反相机拍照。 附表：接头和引物序列编 码接

11、头和引物序列Ead55-CTC GTA GAC TGC GTA CCEad35-AAT TGG TAC GCA GTC TACMad55-GAC GAT GAG TCC TGA GMad35-TAC TCA GGA CTC ATEA005-GTA GAC TGC GTA CCA ATTC A-3MC005-GAC GAT GAG TCC TGA GTAA C-3EA015-GAC TGC GTA CCA ATTC ATC-3EA025-GAC TGC GTA CCA ATTC AGA-3EA035-GAC TGC GTA CCA ATTC ACG-3EA045-GAC TGC GTA CCA

12、ATTC ATG-3EA055-GAC TGC GTA CCA ATTC AAG-3EA065-GAC TGC GTA CCA ATTC AAC-3E015-GAC TGC GTA CCA ATTC AGC-3E025-GAC TGC GTA CCA ATTC ACC-3E035-GAC TGC GTA CCA ATTC ACA-3E045-GAC TGC GTA CCA ATTC ACT-3E055-GAC TGC GTA CCA ATTC AGG-3E065-GAC TGC GTA CCA ATTC AGT-3E075-GAC TGC GTA CCA ATTC AG-3MC015-GAT GAG TCC TGA GTAA CAG-3MC025-GAT GAG TCC TGA GTAA CCA-3MC035-GAT GAG TCC TGA GTAA CTG-3MC045-GAT GAG TCC TGA GTAA CGA-3