中国药科大学药物代谢动力学实验考查知识点整理

1、药物代谢动力学实验考查知识点整理第一部分：HPLC使用注意事项1、HPLC组成：泵、进样器、色谱柱、检测器、数据系统/积分仪2、反相色谱：分离机理：“反相色谱”固定相极性小于流动相极性常用流动相：乙腈、甲醇，水3、色谱柱的分类：按填料：球形、无定形按含碳量：C18、C8按应用：分析柱、制备柱、预处理柱按粒径：150mm*4.6mm,5m等按填料类型：正相柱、反相柱、手性柱4、键合相色谱柱的优缺点：优点：稳定不易流失；应用广泛，可使用多种溶剂；消除硅羟基的不良影响；缺点：pH得在38范围内5、C18柱的活化：90% 10% 90%的甲醇溶液1ml/min依次冲洗30min6、流动相：使用之前需超

2、声脱气（PPT18） 目的：色谱泵输液准确 提高检测性能 保护色谱柱 流动相脱气的方法：加热，抽真空，超声，通惰性气体 流动相组成： 流动相配置： 缓冲溶液现用现配，不要储存时间过长，避免pH值发生变化和成分分解，影响色谱分离的效果； 有机溶液和缓冲液使用前均需经0.45m微孔滤膜过滤； 流动相使用前脱气。7、常用定量方法： 外标法 内标法（准确麻烦） 内标物的要求：化学结构与待测品相似；样品中不存在；不与样品组分发生化学反应；保留值与待测值接近；浓度相当；与其他色谱峰分离好8、样品的预处理： 目的：除杂质；浓缩微量成分；改善分离；保护色谱柱；提高检测灵敏度 方法：高速离心，过滤，选择性沉淀，

3、衍生反应；液固萃取、液液萃取 沉淀蛋白的溶剂： 有机溶剂：乙腈、甲醇 强酸：三氯乙酸、过氯酸 盐：50%硫酸铵、10%TCA分析测定用试剂为色谱纯及以上，水为超纯水第二部分：实验设计1、考虑问题：动物种属、给药剂量、取血时间、采样量、血药浓度大概范围2、分析方法建立：色谱柱、流动相组成、柱温箱温度、样品处理方法、风量下限与标曲范围第三部分：实验相关条件与数据处理 实验一： 1、采血点设计一般原则 为获得给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相（峰浓度附近）和消除相。一般在吸收相至少需要23个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度

4、（Cmax）；在Cmax附近至少需要3个采样点；消除相需要46个采样点。整个采样时间至少应持续到35个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/101/20。为保证最佳采样点，建议在正式试验前，选择23只动物进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。 2、动物给药方式：股静脉注射3、麻醉：腹腔注射20%乌拉坦4、采血方式：眼眶静脉丛采血（0.3ml/次）5、蛋白沉淀方式：10%高氯酸，涡旋，15000rpm 10min,取100ul上清二次离心6、非那西丁色谱条件流动相：50mM磷酸盐缓冲液（6.8g磷酸二氢钾加入到152mL的氢氧化钠溶液（0.1mol/L）中，并稀释到1L）

5、：乙腈（60:40） 色谱柱：岛津 Shimadzu VP-ODS; 1504.6; 5m 检测波长：254nm 柱温：40 进样体积：20L6、参数计算由曲线线性判断为一房室模型，参数计算如下：参数公式值C0由y = 9.511e-0.02 令x=0得9.511l/mlT1/2由y = 9.511e-0.02 令y=0.5C0得34.66mink由T1/2=0.693/k得0.02min-1VdVd=X(给药量)/C0 X=1.25ml*2mg/ml=2.5mg262.8mlCLCL=k*Vd5.25min-1ml-1MRTMRT=1/k50.01minAUCAUC=X/CL480g.min

6、参数非房室值k由-k/2.303=-0.0110.025min-1AUCAUC0100min=278.56 AUC100=C100min/k=18.7 AUC0100min+ AUC100=278.56+18.7297.14g.minAUMCAUMC0100min=9030 AUMC100=t100minC100min/k+C100min/k2= 3141.1 AUMC=AUMC0100min+ AUMC10012171g*min2/mlMRTMRT=AUMC/AUC MRT=1/k40.96min/40minC0C0=Div/VSS=2.5mg/344.65ml7.253l/mlT1/2无C

7、LDiv/AUC=2.5mg/297.14g.min8.41min-1ml-1VssVSS=Div.AUMC/AUC2=2.5mg*12171.1/297.142344.65ml实验二：1、肝微粒体的制备方法版本一：获取肝脏：大鼠禁食不禁水24小时后取肝脏，组织匀浆：称重剪成碎块后加入匀浆液制成匀浆，差速离心：匀浆液49000g离心15min，弃去沉淀和脂肪层取上清液于g离心管中离心20min,弃上清，沉淀用pbs轻轻冲洗。重悬沉淀：用10ml匀浆液重悬，冻存管分装后置-80冰箱内保存蛋白定量：BCA法版本二：大鼠拉颈椎处死, 开腹取肝脏, 用滤纸吸干水分, 称质量。立即放入冰冷的蔗糖溶液中清

8、洗, 用剪刀剪成碎块, 反复清洗至无血色。加 4 倍肝质量的蔗糖溶液, 在冰浴中用组织匀浆机制成匀浆,再超声分散 30 s, 4 C下 10 000 r/min -离心20 min。 上清液用四层纱布过滤除漂浮脂物,滤液在 4 C 下 50 000 r/min 离心 60 min, 弃上清液, 沉淀用焦磷酸钾缓冲液悬浮均匀, 在 4 C 下50 000 r/min 离心 60 min, 沉淀即为肝微粒体。用Tris HCl 缓冲液悬浮均匀, 体积为原上清液的1/ 4 即可, 分装于塑料管中, 于- 80 C保存, 采用Lowry 法测定肝微粒体蛋白浓度 版本三：2、NADPH体系: 葡萄糖- 6- 磷酸(G- 6- P) 葡萄糖 6 磷酸脱氢酶(G- 6- P- OH) -NADP+ 氯化镁 5Mm3、温孵实验步骤： 肝微粒体（0.2mg/mL,80L），非那西丁溶液,37水浴预温孵5min,加