实验二_牛肉膏蛋白胨培养基的制备及高压蒸汽灭菌

1、实验二 牛肉膏蛋白胨培养基的制备及高压蒸汽灭菌一 实验目的：掌握培养基的配制原则与方法；熟悉手提式高压灭菌器的使用方法和注意事项；二 实验材料：器材：试管（20个）、三角瓶（6个）、封口膜（10个）、牛皮纸1大张（可用报纸代替）、报纸若干、烧杯（16个,250ml）、量筒（6个）、玻璃棒（12个）、培养皿（36个）、试管架（6）、铁架台（6）、玻璃漏斗（6），吸管（30个）、称量纸，剪刀（6把）、天平、牛角匙（3个）、pH试纸1本，高压蒸汽灭菌锅等。试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、NaOH（0.1mol/L）等三 实验原理：牛肉膏蛋白胨培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有

2、时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。四 实验步骤：1.准备工作：器皿包扎为了灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿均需包扎。（1）培养皿 洗净烘干后每10套迭在一起，用牢固的纸卷成一筒，外面用绳子捆扎，以免散开，然后进行灭菌。到使用时在

3、无菌室中才打开取出培养皿。（2）吸管 洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，及口中的微生物吸入管而进入培养物中造成污染。塞入棉花的量要适宜，棉花不宜露在吸管口的外面，多余的棉花可用酒精灯的火焰把它烧掉。每支吸管用一条宽约45厘米，以45左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管。 （3）棉塞制作：每个学生做2个棉塞线绳捆绑方法（示范），每个学生都练习。2.牛肉膏蛋白胨培养基的制备配方：牛肉膏：1.5g 蛋白胨5.0g 氯化钠2.5g

4、 水500mL 琼脂 7.5g pH 7.2（1）称量 准确称取各种成分。一些不易称量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放称量纸上称量，然后连同称量纸一起放入烧杯中。（2）溶解 向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用水洗下后，加热搅拌全溶后稍放冷。（4）调pH值 精密pH试纸测定其pH值，并用NaOH调至所需pH值（5）分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆，挂上标签，灭

5、菌备用。（6）包扎 纸上表明培养基的名称、配制日期等。（7）灭菌 培养基用0.1Mpa高压蒸汽灭菌1520min，利用高压灭菌器，使水的沸点在密闭的灭菌器内随压力升高而增高（见表6-2），来提高蒸汽的温度和灭菌的效率。在同一温度下湿热的杀菌效率比干热大，因为微生物细胞蛋白质在湿热情况下，易干凝固（见表6-3）。同时湿热的穿透力强，当水蒸汽与被灭菌的物品相接触后，便放出汽化潜热，逐步提高被灭菌物品的温度，直至与水蒸汽的温度相等，达到平衡为止，从而提高灭菌效率。手提式高压灭菌锅灭菌的操作步骤如下：（1）在灭菌器内加入一定量的水（有的灭菌器内加水至止水线）。将用防水纸包扎好的灭菌物品如培养基、无菌水等，放进灭菌器内。（2）接通电源，进行加热。（3）当压力到达5bl/in2时，打开放气阀，使锅内的空气和水蒸汽一同排出，直至压力表的压力恢复到零，然后关闭排气阀，继续加热。（4）当压力表的压力到达15bl/in2（即 1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度达到121，维持30min不变。对热不稳定的培养基灭菌时，应适当降低压力，延长时间。（5）灭菌时间一到，切断电源，待压力下降至零时，才能打开排气孔，然后打开灭菌器盖，取出物品。如果灭菌后的固体培养基要做成斜面，需趁热放置。还需检查培养基灭菌是否彻底。（8）斜面的摆放方法：学生每2人一组，按照配方用烧杯配1