细胞工程：8-2动物细胞培养与制药

1、1,第四篇：生物产品生产,第8讲 动物细胞培养生物制药,2,本节主要内容,动物细胞培养的特点 动物细胞培养的条件、方式 原代培养、传代培养技术 适合大规模培养的细胞系 动物细胞培养的生物反应器 微载体及其培养特点 动物细胞培养的影响因素与培养工艺,3,本节关键问题,动物细胞体外生长特点 动物细胞培养的培养基特点 动物细胞原代培养方法 动物细胞传代培养方法 常用的大规模培养的动物细胞株特点 适合动物细胞大规模培养的生物反应器 微载体培养技术 动物细胞培养的影响因素及灌注培养工艺,4,第二节 动物细胞培养生物制药,5,一、适合工业化生产的细胞株,包括：原代细胞、二倍体细胞、连续细胞系、融合细胞和重

2、组细胞。,6,1、原代细胞,成功传代之前的培养，通常指第一代至第十代以内的培养细胞。 大多数组织可以制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一。 特点：生长分裂不旺盛。保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。 应用：药物检测、药理研究 缺点：需要大量动物组织、成本高、费时费力等。,7,2、二倍体细胞,具有正常细胞的特点：二倍体染色体、具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。 一般从胚胎中分离原代细胞，经传代培养的细胞 有限细胞系：传代次数不超过50代 WI-38： 1961年Wister 38研究所从女性高加索人的正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系。培增时间24h；贴壁生长；第一

3、批获得批准用于生产的二倍体细胞有对病毒敏感，第一个用于疫苗（脊髓灰质灭活疫苗）生产。 MRC-5：来自14周龄男性胎儿的正常肺组织,该细胞老化前能传代42到46次。二倍体，生长比WI-38快。,8,2.1 有限细胞系,初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称为细胞系。 有限细胞系：生长和寿命有限；二倍体细胞系。,9,2.2 无限细胞系,细胞永生性也称不死性，能连续传代，也称连续细胞系。 特点：细胞无限分裂；不具有接触抑制；大多已发生异倍化，具有异倍体核型，有的成为恶性细胞。 本质：转化细胞。 应用：理想的药物生产细胞系,10,3、融合细胞,通过细胞融合技术得到具有两亲本特征的细胞，无限增殖。

4、 应用：杂交瘤细胞 视频：单克隆抗体制备 ,11,人源化单克隆抗体简介,鼠源性单抗仍带有鼠抗原决定簇而使其应用存在一定的局限性: （1）不能有效地激活人体中补体和Fc 受体相关的效应系统 （2）被人体免疫系统所识别, 产生人抗鼠抗体( Human antigen mouse antibody,HAMA) （3）在人体循环系统中很快被清除掉。 通过人源化改造获得低免疫原性、高效性、人源性单克隆抗体，解决鼠杂交瘤单抗用于人体的变态反应的问题。,12,人源化单克隆抗体简介,人鼠杂交瘤：融合方法基本与鼠鼠杂交瘤相同。亲本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本B细胞则来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞

5、。 分泌性能很不稳定。 人人杂交瘤：可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系与人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体。 人人杂交瘤核型稳定，然而遗憾的是可供利用的人类骨髓瘤细胞种类非常有限。,13,4、基因工程细胞,将编码药用蛋白质的基因重组到动物细胞构建 特点：正常细胞异倍体化；融合或重组 应用：动物细胞生物制药,14,哺乳动物细胞培养生产重组蛋白药物,(中国仓鼠卵巢CHO,鼠源骨髓瘤NSO， 小鼠骨髓瘤SP2细胞),15,5、转化细胞,细胞转化是指细胞发生遗传改变而产生永生化 由限定性细胞系转化为连续性细胞系 特点：倍增时间短；培养条件和生长因子要求低；适宜大规模培养。 常由于染色体断裂而变成异倍体，失

6、去正常细胞的特点 曾因安全性不能确认而没有大量使用。 随着对肿瘤发生机制等研究的深入，转化细胞于20世纪80年代获得批准用于生产。,16,5.1 转化方法,细胞自转化:自发转化现象。在正常二倍体长期传代过程中出现。 可能的因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污染等。 人工诱发转化:采用诱导剂使正常细胞发生转化。 凡是可以改变DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、物理和病毒诱导剂。,17,二、常用细胞株,CHO细胞:从中国仓鼠卵巢分离的细胞，亚二倍体（比二倍体减少1条(2n-1)或几条染色体），有多种突变株。贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压改变有较高的忍受能力。 BHK-2

7、1细胞:从英国幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样，异倍体。常用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白(如重组凝血因子VIII) Verocell:从非洲绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体，贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞之一。 WI-38细胞,18,HeLa细胞系,源自一位美国妇女海莉耶塔拉克斯（Henrietta Lacks）的宫颈癌细胞。 这名美国妇女在1951年死于该癌症。 细胞株无限分裂，至今都被不间断的培养，至2015年已经整整64年。增值迅速，每隔24小时细胞数量就增加一倍 广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。 2013年3月初，世界上最著名的人

8、体细胞系海拉细胞基因组发布。 海拉细胞系的提取并未获得Lacks本人的同意。,19,Her name was Henrietta Lacks, but scientists know her as HeLa. She was a poor Southern tobacco farmer who worked the same land as her slave ancestors, yet her cellstaken without her knowledgebecame one of the most important tools in medicine. The first “immo

9、rtal” human cells grown in culture, they are still alive today, though she has been dead for more than sixty years.,The immortal life of HeLa,20,第三节 动物细胞大规模培养,1962年开始大规模培养尝试，目前已经成为生物制药的重要支撑技术：疫苗、抗体、蛋白类药物等。,21,一、定义,动物细胞大规模培养（cell large-scale culture）是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等）在生物反应器（Bioreactor）中高密度大量培养动物细胞

10、生产生产生物制品的技术。,22,二、小规模培养：转瓶培养系统,在转管培养基础上为扩大培养量而改进的。 固定在旋转支架上，倾斜一定角度。细胞贴附在转瓶或转管的内表面，培养液随旋转而流动，细胞交替接触营养和空气。 缺点：劳动强度大、占地空间大、细胞产率低、监控不便。,23,三、动物细胞培养的生物反应器,悬浮培养：细胞增殖快、产量高、过程简单 如何满足细胞贴壁要求又能充分利用反应器空间体积？ 如何设计生物反应器，降低动物细胞培养的剪切力损伤？ 设计依据：除了以人工诱变为目的的培养外，其设计原则应是尽量模拟培养物在生物体内的生长环境。,24,1、动物细胞培养的生物反应器的分类,机械搅拌式：浆叶改造、加

11、挡板（减小液面上的旋涡）等 气升式/鼓泡式：传质/气需要改造 微载体培养：解决空间分布与贴壁，连续灌注培养 中空纤维式：解决贴壁、营养气体有效吸收交换、连续灌注培养,25,供氧方式的改进 笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种, 即气泡用丝网隔开, 不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力, 以满足细胞生长的要求。,1.1 改造后的鼓泡式反应器,26,1.2 机械搅拌结合鼓气的生物反应器,机械搅拌结合鼓气的微载体培养用生物反应器。 这种类型的生物反应器搅拌速度一般都非低，尽量减少剪切力对微载体及细胞的影响。,27,1.3 中空纤维生物反应器,中空纤维是一种细微的管状结

12、构，管壁为极薄的半透膜。 由微孔中空纤维管束制成的中空丝，纤维束由外壳包裹，因此可分为中空内腔与中空外腔两部分，每部分各有其进出口。 新鲜培养液从中空内腔导入。气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体内部。,28,类型,柱式,板框式,中心灌流式柱式,29,中空纤维生物反应器的特点,模拟细胞在体内生长的三维状态。 既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。 细胞如果是附壁性的，则附着在纤维外壳表面，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化冲出； 若是非附壁性的，应采用微滤材料将其截留在反应器内而让培养液排出。 优点：无剪切力影响，高密度培养，传质效率高。 缺点：容易堵塞，价钱昂贵。,3

13、0,1.4 微载体培养,微载体：微载体是直径60-250m的适用于贴避依赖型细胞生长的微珠。 1967年开发。一般由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。 将传统的一维平面贴附扩展为三维立体贴附，摆脱了传统的培养瓶（管）培养限制。 既能满足动物细胞的贴壁要求，又能充分利用生物反应器的内部空间。,微载体使利用生物反应器进行动物细胞大规模培养成为可能,31,微载体特点,1-好的生物相容性：无毒无害，有好的黏附性，一般带正电荷 2-大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一 3-良好的传质性能 4-强的机械性能：重复利用、保护细胞 5-好的热稳定性：高压灭菌,32,制备微载体的材料,1.人工合成聚合物 聚甲基丙

14、烯酸-2 羟乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。 2.天然聚合物及其衍生物 明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物、海藻酸盐,33,常用微载体类型,1-实心微载体（Cytodex系列） 优点：易于细胞在表面贴壁，机械强度高，容易接种操作 缺点：细胞浓度低；细胞容易受剪切力、搅拌、碰撞等影响；细胞易老化脱落 2-多孔微载体 优点：比表面积更大，使细胞免受机械损伤，得到的细胞浓度高，可降低血清用量，可以采用高的搅拌速度和通气量 缺点：容易产生营养传递障碍，积聚代谢副产物。,34,2、微载体培养技术,将贴壁培养与液体培养相结合的一种动物细胞大规模培

15、养技术。,35,2.1 微载体培养,微载体培养动物细胞经过黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。 细胞在微载体表面的贴附是关键。 黏附主要是靠静电引力和范德华力。 电荷：一般细胞在进入生理pH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。,36,影响贴壁的其它因素,培养基组分：添加血清有助于细胞贴壁。提供促接触和伸展因子。 搅拌：不能仅依靠大的搅拌速率保证接触概率。在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。 其它因素：培养基偏酸或偏碱、微载体不洁等不利条件都不利于细胞贴壁。,37,生长在载体上的动物细胞HEK293,38,人上皮细

16、胞SoloHill微载体生长状况,39,40,2.2 细胞收获与微载体再生的具体方法,振荡，去除脱落的细胞及细胞碎片 柠檬酸浸泡，使载体内部细胞裂解脱落 碳酸氢钠碱性溶液浸泡，使细胞进一步脱落 胰蛋白酶浸泡消化 水洗，缓冲液洗涤，灭菌备用,41,将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技术。 优点： （1）避免了细胞收获与微载体再生过程，方便、高效。 （2）防止细胞调亡，延长了细胞寿命，提高了细胞分泌物的产量。,2.3 球传球接种技术,42,2.4 微载体培养的优点,模拟了体内三维生长环境，减轻接触抑制，可多层生长。 解决了生物反应器的空间分布问题，单

17、位体积培养液的细胞产率高； 把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点； 可用显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况； 简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；培养基利用率较高； 放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能； 方便接种与收获，劳动强度小； 培养系统占地面积和空间小。,HepG2在alginate球中生长HepG2在alginate球中死活染色 C3A在生物反应器表面呈球状生长,Tissueflex三维灌注式细胞培养仪,43,TissueFlex微型生物反应器,TissueFlex恒温培养箱,2.5 三维细胞培养,将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培

18、养, 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长, 构成三维的细胞-载体复合物。 一般三维细胞培养所采用材料多是由琼脂糖、胶原纤维或基质胶制成。不过所有这些材料都有一个特性：所含孔径混杂，大小不一。 改进：利用具有疏蛋白性（protein-repellent，蛋白排斥性）的柔性聚合物，并以一种可结合蛋白材料作为聚合物的盒状支撑点，通过激光直刻法制作出一种特殊的聚合物支架。,44,这种支架的疏蛋白结构由25微米高的支柱组成，各个支柱之间通过细棒连接，连接点高度不一，然后盒状支撑点被精确地放在细棒中间。当含有粘附蛋白的溶液浸入支架时，蛋白只会与盒状支撑点相结合，两小时内，个体细胞占满支架，且只

19、粘附在特定位点。由此，通过改变支撑点和细棒的位置，可实现对细胞形状的三维控制。,45,46,2.6 动物细胞培养的影响因素,培养过程中的细胞凋亡会减少细胞浓度，降低目标物质产量。 细胞培养过程中的细胞凋亡的因素有哪些？,47,引起细胞调亡的因素,有毒物质或抑制因子产生 氨：来自培养基+代谢，积聚影响细胞生长。 乳酸：来自细胞的糖代谢，抑制乳酸脱氢酶，抑制糖酵解，能量产生减少，抑制细胞生长。 甲基乙二醛：脂类、氨基酸的代谢产物，对细胞有潜在的损伤作用。 CO2：毒性 营养成分耗尽 如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血清、无蛋白培养

20、基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更容易发生凋亡。 其他物理因素 渗透压、pH、温度、载体、搅拌等,48,3、培养工艺根据营养添加方式,分批培养 流加培养 连续培养 连续灌注培养（与3的区别在于无细胞流出） 1、2是微生物、植物细胞培养的主要方式 2、4是动物细胞培养的主要方式。,49,4、动物细胞大规模培养生产药物存在的问题,细胞密度低，产物浓度低。 细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力易丢失，或产物活性易降低。 动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体很昂贵。因此大多仅能在小规模范围内研究，难以转化为生产力。 目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。 在线监测水平技术不完善，限

21、制了优良培养系统的开发。,50,小结,微载体培养技术：微载体特点及相关技术，如微载体再生、细胞收获与接种 动物细胞培养的生物反应器 动物细胞大规模培养：基本流程；问题-细胞凋亡；工艺。,51,今后应重点开展的工作,细胞培养过程代谢和产物形成机制等方面的理论研究。 开发能高密度生长、大量分泌目标产品的细胞系。 开发细胞生长性能优良、细胞解离容易，并能重复使用的新型廉价的微载体。 研制高效的培养模式与系统，包括新型的无菌生物反应器培养系统与工艺、先进的在线检测、分析与自动控制技术等。 相关基因工程与细胞培养技术结合的技术研究。,52,52,问题与讨论,52,53,应用举例：动物细胞培养生产重组人红细胞生长素rHuEPO,54,1、红细胞的功能,血液的运输功能主要是靠红细胞来完成的:运输O2和CO2; 缓冲酸碱度(血浆pH值: 7.357.45). 贫血：血液中红细胞数量,血红蛋白浓度低于正常. 贫血时，红细胞的数量减少或质量下降