微生物发酵产酶技术演示课件

1、微生物发酵产酶技术,任务分配 PPT讲解人：张建华 问题讲解：梅延超、张娜、 李虎,1,教学目标 产酶微生物及其保藏 酶的发酵生产工艺 提高酶产量的措施,2,一）利用微生物产酶的优点,1.微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。 2.微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。 3.微生物培养基来源广泛、价格便宜。 4.可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。 5.可以利用以基因工程为主的近代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种,3,二）常用产酶微生物的要求 1.不是致病菌，不产生有毒物质的微生物，在系统发育上最好是与病原体无关；这样才能

2、确保酶生产和应用的安全； 2.能够利用廉价原料，能在便宜的底物上良好生长，繁殖快, 发酵周期短，产酶量高； 3.菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易感染噬菌体； 4.产生的酶容易分离纯化，最好选用产生胞外酶的菌种，有利于酶的分离，回收率高； 5.对医药和食品用酶，应考虑其安全性,4,一、产酶微生物及其保藏 （一）常用产酶微生物 工业中常用的产酶微生物主要包括细菌、放线菌、真菌、酵母等。其中不少性能优良的微生物菌株已经在酶的发酵生产中广泛应用。常用的产酶微生物,5,二）菌种的保藏 酶制剂生产工业中，生产菌种（微生物）的产酶能力的退化是常发生的。为防止菌种退化，一是尽量减少传代次数，二是做好菌种保

3、藏工作。菌种保藏的方法很多，其基本原理是采用低温、干燥、绝氧等条件抑制菌种的代谢活动，使之停止繁殖，处于休眠状态。常用的菌种保藏方法有： 1.斜面冰箱保藏法：实验室最常用的一种保藏方法，适于保藏 细菌、放线菌、酵母菌及霉菌等。将不同菌种接种在适宜的斜面培养基上，在适宜的温度下培养，使其充分生长，培养好的菌种置于45 。C冰箱中进行保藏。 2.砂土保藏最适合于霉菌、芽孢杆菌、放线菌等的保藏，方法简便易行，般可保存数年至数十年,6,3.液体石蜡油封法：将灭菌过的液体石蜡注入菌种斜面试管中，以隔绝氧气并防止水分蒸发，抑制细胞代谢从而达到延长保藏期的目的。此法适于保藏霉菌、酵母菌、可保藏菌种打1-2年

4、，且操作简单易行，但有些细菌（如固氮菌、乳酸杆菌、分枝杆菌和毛霉、根霉等）不宜用此法保存 。 4.冰冻干燥法 ：大多数微生物都可用冰冻干燥法来保藏，冰冻干燥是利用真空下结冰状态的水分子直接升华汽化而使样品干燥的。此法适用于绝大多数的微生物，保藏期长，有时可达15年以上。在冰冻和脱水过程中为防止对细胞造成损害，可用脱脂牛奶等作为保护剂来制备细胞悬液,7,5. 液态超低温保藏法：将细胞在有甘油等保护剂存在下，先置冰箱中逐渐降温，然后置液氮中储藏。此法可长期保存菌种,二、酶的发酵生产工艺 酶发酵生产的目的是获得大量所需要的酶。因此，除了选择性能优良的产酶细胞以外，还必须满足细胞生长、繁殖和发酵产酶的

5、各种工艺条件，并需要根据发酵过程的变化进行优化控制。酶发酵生产的一般工艺流程如下,8,9,一）菌种活化与扩大培养 1.菌种活化 生产上为了防止菌种退化，一般都采用各种方法保藏菌种。保藏的菌种活性很低，处于休眠状况，使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动，这一过程称为菌种活化。 2.菌种的扩大培养 扩大培养是为了将活化了的细胞再经过扁平或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种的过程,10,二）发酵培养基的配制 1.培养基的基本组分 培养基的组成成分因所培养的生物和目的酶不同而各有差别。但是，各种培养基都包括碳源、氮源、无机盐、生长因素和水

6、。 2. 微生物发酵产酶常用的几种发酵培养基 （1）枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基 玉米粉8，豆饼粉4，磷酸氢二钠08，硫酸铵0.4，氯化钙0.2，氯化铵0.15（自然pH）。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基 玉米粉4，豆饼粉3，麸皮3.2，糠1，磷酸氢二钠0.4，磷酸二氢钾0.03（自然pH,11,三）发酵方式 酶的发酵方式根据微生物培养方式的不同，可以分为固体发酵、液体深层发酵和固定化细胞发酵等。 1.固体发酵法 指微生物在含有吸附水分而非游离水的潮湿固体上生长。在酿酒工业的糖化曲和调料工业的酸性蛋白酶，特别适用于各种霉菌发酵产酶。其最大特点是固体曲的酶活力高。主

7、要的固体发酵法有浅盘法、转桶法、后层发酵法等。 2.深层液体发酵法 是采用液体培养基，置于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。此法不仅适用于微生物细胞，也可用于各种植物细胞和动物细胞的悬浮培养和发酵。 3.固定化细胞发酵法 又称为固定化细胞或固定化增值细胞，是采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞,12,四）发酵条件的调控 1.PH 在配制培养基时应根据微生物的需要调节pH值。一般情况下，多数细菌、放线菌生长的最适pH 为中性至微碱性（ pH6.5-8.0）；而霉菌、酵母的最适生长pH值则偏酸性（ pH4-6）；植物细胞生长的最适pH

8、值为 5-6；培养基的pH值不仅影响微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有作用。常用的方法有根据PH值的变化情况加酸或是加碱进行调节，也可以通过发酵过程中不了来控制PH。 2.温度 有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度往往有所不同，而且往往低于生长最适温度。原因是在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量,13,3.溶解氧 溶解氧是指溶解在培养基中的氧气。在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中溶解氧的量保持恒定。 （1）调节溶解氧的方法主要有：

9、 a.调节通气量 增大通气量，可以提高溶氧速率。 减少通气量，则使溶氧速率降低,在发酵生产过程中，应尽量控制溶氧速率等于或稍高于耗氧速率,14,b.调节氧分压 增加发酵容器中的空气压力 增加通入空气中的氧含量 都能提高氧分压，从而使溶氧速率提高。 c.调节气液接触时间 增加液层高度 降低气流速度 在反应器中增设挡板 延长空气流经培养液的距离 d.改变培养液的性质 改变培养液的组分或浓度，有效地降低培养液的黏度 设置消泡装置或添加适当的消泡剂,15,e.调节气液接触面积 在发酵容器的底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培 养液中，是增加气液接触面积的主要方法 装设搅拌装置 增设挡板 三、提

10、高酶产量的措施 在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，除了选育优良的产酶细胞外，还可以采用一些与酶发酵工艺有关的措施，例如： 1.添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。 诱导物一般可以分为3类： （1）酶的作用底物 例如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物,16,2）酶的反应产物 例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。 （3）酶作用底物的类似物 例如异丙基-D-硫代半乳糖昔（IPTG）对-半乳糖昔酶的诱导效果比乳糖高几百倍。其中使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。 2.控制(降低)阻遏物的浓度 微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。阻遏作用根据其作用机制的不同，可以分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物引起的阻遏作用,17,3.添加表面活性剂 由于它表面活性剂可以与细胞膜相互作用，改变(增加)了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打