计算机在生命科学中的应用第四次作业

1、对硫矿硫化叶菌的一段未知功能蛋白的基因进行引物设计 实验目的：1.利用软件Vector NTI Explore 对硫矿硫化叶菌DNA序列进行酶切找到含目的基因的比较小的片段2. 利用软件Vector NTI Explore进行引物设计引物 实验材料：Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）的一段DNA 序列。 实验原理：1. 引物设计的原则：A 长度在1835bp，GC含量在40%60%之间，内部无发卡结构，Tm值最好接近72；B 引物之间避免形成二聚体；C 引物3端和模板之间不应少于12个连续碱基相匹配；D 在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片断；有时

2、需要在引物的3端加上适当的酶切位点。E. 引物3端不能选择A，最好选择T。F. 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。 引物的5 端决定着PCR产物的长度，引物5 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等实验内容：试验中用到古生菌的序列长12389bp，其中80-709bp是我们需要的未知功能蛋白质的基因序列，利用Vector NTI Explorer分析酶切位点，依次用 PStI、EcoRI和ClaI处理，在使用另一种酶处理之前，先用琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，最后得到11429的DNA片

3、段，是理想的PCR模板。再次使用Vector NTI Explorer分析，设计 9的PCR引物，使用PCR扩增得到目的DNA。 1, 首先我们要用限制性内切酶将冗余的片段切去。找目的基因所在的片段这是Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）DNA序列利用软件Vector NTI所能找到的所有酶切位点：因为该物种中限制性内切酶PstI 只有一个切点，且位于3370bp处，可以一次性出去一大段多余的部分，所以先用PstI酶切并进行电泳，选择琼脂糖凝胶进行电泳，结果如下图：电泳中DNA片段越大则跑的越慢，DNA片段越小跑得越快，所以03370bp应该跑得比另一条带快，可

4、以回收跑得最远的那条带，那段序列应该是13370bp。 为了一步就能得到我们想要的目的片段，在13370bp处，用 EcoRI和ClaI双酶切再进行电泳，这样做的目的在于可以一步就能得到我们想要的目的片段，而且电泳后的条带清晰，在实验室中好回收。而用这两种酶切产生的片段长度分别1429bp，943bp，342bp，563bp，111bp，电泳结果如图：，同理， 我们将 1429bp处的电泳条带中的DNA序列取出，回收里面的DNA,这就是我们需要的含有目的基因的DNA序列。这一段序列就有一个酶切位点AvaI，如图9所示。用工具找它的ORF，ORF的分析结80709bp处， 1AAAATCTTCC

5、 AATTATTTCA GTAGTGTCTA TCTTTTAATA TGAAAAATTT TTGATGTTTT AGTTTGAAAA ATTTATTAAG TGAGAAAACA ACTCTCTATTTTTTAGAAGG TTAATAAAGT CATCACAGAT AGAAAATTAT ACTTTTTAAA AACTACAAAA TCAAACTTTT TAAATAATTC ACTCTTTTGT TGAGAGATAA 101GGAATGAAGA ATCTTTATAA AATTAACTTT TCAATATCAC ACCAAGGTTG CTGGACCAGC AAAATAAAAG ATAGTGTTGT

6、TACCTTAAAT GTATCAAAATCCTTACTTCT TAGAAATATT TTAATTGAAA AGTTATAGTG TGGTTCCAAC GACCTGGTCG TTTTATTTTC TATCACAACA ATGGAATTTA CATAGTTTTA 201ATAATAATAA GAAAGTCAGA GTCACAATAG CTTCTCCAAA ATTAATAGTA ACTGACCTAA AAAGGTCAGA AAACGTTTAC GAAATTCTAA AGTATAGAAATATTATTATT CTTTCAGTCT CAGTGTTATC GAAGAGGTTT TAATTATCAT TG

7、ACTGGATT TTTCCAGTCT TTTGCAAATG CTTTAAGATT TCATATCTTT AvaI 301GGTAAAAGGG GGTTATATAA TTGACTTCCT TGAAGATCTG AGTACTACAA TTTCAGGATA TATACTCTCG AGCAGTAATA TATTAGAATA TAGAAATGTCCCATTTTCCC CCAATATATT AACTGAAGGA ACTTCTAGAC TCATGATGTT AAAGTCCTAT ATATGAGAGC TCGTCATTAT ATAATCTTAT ATCTTTACAG 401GTAAGGGAAG GAATAG

8、AAAA GTGGGAAGTA ACAACTTTAG CCAAATCTTT AGTAGGCAAA TTATCAGAAA GATTTCCCAT AGATAGCATT GTAGTTAAAGCATTCCCTTC CTTATCTTTT CACCCTTCAT TGTTGAAATC GGTTTAGAAA TCATCCGTTT AATAGTCTTT CTAAAGGGTA TCTATCGTAA CATCAATTTC 501AAATAAAGTT TTCAGATATG TTCTATAATG GTTTGACAGA AAAGGAGATA CTAGTCCTAA AAACCGCAAT AACTATGGGA TATTTCA

9、ATT ATCCAAGGCATTTATTTCAA AAGTCTATAC AAGATATTAC CAAACTGTCT TTTCCTCTAT GATCAGGATT TTTGGCGTTA TTGATACCCT ATAAAGTTAA TAGGTTCCGT 601AATAAAAGCT AAGGAAATTG CTGAAAAATT AGGTATCTCC AAGCAAGATT TCCTTTATCA TCTGCGAAAA TCAATAGAGA AAATAATTTT CTCATCAGTTTTATTTTCGA TTCCTTTAAC GACTTTTTAA TCCATAGAGG TTCGTTCTAA AGGAAATAG

10、T AGACGCTTTT AGTTATCTCT TTTATTAAAA GAGTAGTCAA 701ATAGAATAGT AATTCATGCA TATTAAATTA CTAAAAATTT AAGTGATTAA AAAGGTTTAA AAATAATATA AGACTCCTTT ATATTCAAAG ACTATAATCATATCTTATCA TTAAGTACGT ATAATTTAAT GATTTTTAAA TTCACTAATT TTTCCAAATT TTTATTATAT TCTGAGGAAA TATAAGTTTC TGATATTAGT 801CCGAACTTCT TAATTCTGTC TGGAAAT

11、CTG CTCTTTATCA CATAATATGT AATTATGTGA ATCAAAAGAA TAGCCCAAGC TGCATAAACT GCTATATTTAGGCTTGAAGA ATTAAGACAG ACCTTTAGAC GAGAAATAGT GTATTATACA TTAATACACT TAGTTTTCTT ATCGGGTTCG ACGTATTTGA CGATATAAAT 901ATGGGAAAGC TGGCGCAGGG TAAGTACCAA AATATATTAC AGCAATATAT AATAGTATTG AAATTATCGG TATCACTACG TGTTTCGCTA TGTTAGCC

12、GTTACCCTTTCG ACCGCGTCCC ATTCATGGTT TTATATAATG TCGTTATATA TTATCATAAC TTTAATAGCC ATAGTGATGC ACAAAGCGAT ACAATCGGCA 1001ACGCATTTTA ACCTTACGTA CAATTAACCC TAAGGCAGCA AATAAATGAC CTAAGGCGAC GTAGAATGAG CCAAATGTTA TTAAAAATAT ACTAGCCTCTTGCGTAAAAT TGGAATGCAT GTTAATTGGG ATTCCGTCGT TTATTTACTG GATTCCGCTG CATCTTACT

13、C GGTTTACAAT AATTTTTATA TGATCGGAGA 1101AACGGACCTA GAATGTAACC ACTTATAAGG CTAAGAGCAC CTGTAACAAT ACCAGTAAGT ATTATTGCAT TACCCGGCAC ACCGTATTTA TTAACTTTTGTTGCCTGGAT CTTACATTGG TGAATATTCC GATTCTCGTG GACATTGTTA TGGTCATTCA TAATAACGTA ATGGGCCGTG TGGCATAAAT AATTGAAAAC 1201AAAAGACTTT AGGATATAAT ACACCATCCC TAGCC

14、ATACC GAATATCATT CTACTCCCAC TAGTAGCAAA CGCTAATGCA GAAGAGTTAA ACATAAACGCTTTTCTGAAA TCCTATATTA TGTGGTAGGG ATCGGTATGG CTTATAGTAA GATGAGGGTG ATCATCGTTT GCGATTACGT CTTCTCAATT TGTATTTGCG 1301TACAAGTATT ATTAACATAT ATACAATAGC GGGATTGAAA TACTTACTAT AAATCACTAT CATTGGGTCT GGAAGATTAG CATAATTAAA CATATTATTTATGTTC

15、ATAA TAATTGTATA TATGTTATCG CCCTAACTTT ATGAATGATA TTTAGTGATA GTAACCCAGA CCTTCTAATC GTATTAATTT GTATAATAAA 1401ATTCCATAAA CTATCGTCTG CGCATAAGAATAAGGTATTT GATAGCAGAC GCGTATTCTT。 2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点。 HI (430)pUC182686 bpA

16、PrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (435)BamEcoRI (451)HindIII (400)PstI (416)SmaI (437)XmaI (435)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367) PUC18:依靠LacZ-基因的选择重组体的筛选：含有重组PUC18分子的E.coli细胞在含氨苄青霉素和X-Gal的琼脂糖板上只需一步就可识别出来。结果：其中白色菌落的含重组体，蓝色菌落得不含重组体。3. 酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的5 端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。1.在EcoRI和PstI之间加

17、上目的基因。在引物设计框中在正义链5端加PstI酶切位点，在反义链加EcoRI，根据引物设计原则修改参数，设计结果如下 PCR Analysis #1: Product of length 764 (rating: 171) Contains region of the molecule from 80 to 831 Tm: 71.2 C TaOpt: 51.0 C GC: 29.7Sense Primer: CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 53

18、.7 C GC: 45.8 dH: -170.4 kcal/mol dS: -442.4 cal/mol dG: -36.7 kcal/molAntisense Primer: GAATTC GCAGATTTCCAGACAGAA Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 56.4 C GC: 41.7 dH: -177.6 kcal/mol dS: -459.1 cal/mol dG: -38.9 kcal/molTm Difference: 2.7GC Difference: 4.2#2: Product

19、 of length 765 (rating: 171) Contains region of the molecule from 80 to 832 Tm: 71.2 C TaOpt: 51.0 C GC: 29.7Sense Primer: CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 53.7 C GC: 45.8 dH: -170.4 kcal/mol dS: -442.4 cal/mol dG: -36.7 kcal/molAntisense Primer: GAATTC AGCAGATTTCCAGACAGA Similarity of primer without 5 attachment: 100.0% Length: 24 Tm: 54.2 C GC: 41.7 dH: